Production and characterization of heptamerized form of PA83 of Bacillus anthracis IN Nicotiana benthamiana plants as vaccine candidate against anthrax

Abstract

Bacillus anthracis (B. anthracis), dünyada biyolojik terör silahı olarak kabul edilen gram pozitif bakteri olan şarbonun etken maddesidir. Hem hayvanlar, hem de insanlar için ölümcül olabilmektedir. Şarbon toksini, toksik olmayan üç proteinden oluşmaktadır; Koruyucu antijen (PA); Ödem faktörü (EF) ve Ölümcül faktör (LF). Koruyucu antijen (PA), şarbon toksininin merkezi bileşeni olup, diğer iki proteinin konakçı hücreye taşınmasından sorumludur. PA83'ün (83kDa) proteolitik aktivasyonundan sonra, PA20 (20kDa) fragmanı serbest bırakılır; kalan PA63 (63kDa), halka şeklinde heptamerler oluşturmak için hızlı bir şekilde kendi kendine birleşmektedirler. Proteolitik bölünme, diğer iki faktör LF/veya EF ile bağlanmaya izin veren heptamer yapısının oluşumu için önemlidir. Doğal konakçıda, B. anthracis PA83 proteini bir glikoprotein değildir, ancak ökaryotik ekspresyon sistemlerinde olduğu kadar bitki ekspresyon sistemlerinde de anormal şekilde glikozillenebilen bazı potansiyel glikosilasyon bölgelerine sahiptir. Anormal glikosilasyon, proteinlerin önemli epitoplarını maskeleyerek uygunsuz katlanmaya yol açabilmektedir. Son zamanlarda, Mamedov vd., bitki bazlı ekspresyon sistemlerinde in vivo deglikosilasyon stratejisini göstermiştir. Bitki bazlı ekspresyon sistemleri, rekombinant proteinlerin üretimi için alternatif bir platformdur. Bu sistemler ölçeklenebilir, ekonomik ve güvenli ürün sağlamaktadırlar. Ek olarak, bitki bazlı ekspresyon sistemleri, proteinlerin biyolojik özelliklerini etkileyen ökaryotik post-translasyonel modifikasyonlara (PTM) sahiptirler. Daha önce yapılan çalışmalarda bildirildiği gibi, bitkide üretilen PA83'ün in vivo deglikosillenmiş monomer formu, şarbona karşı aşı adayı olarak aktif ve istikrarlı bir proteindir. Bu çalışmada, Nicotiana Benthamiana (N. benthamiana) bitkilerinde geçici ekspresyon sistemi kullanılarak, PA83 proteininin in vivo heptamerize formunun üretimini göstermeyi amaçlanmaktadır. Bu nedenle, PA63'ün heptamerize formunu üretmek için, B. anthracis PA83 geni önce deglikosilasyon enzimleri EndoH veya PNGaseF ile birlikte eksprese edildi ve daha sonra in vivo insan furini ile kesilmiştir. Tezle ilgili yapılacak olan çalışma planımız; i) PA63'ün heptamer formunu jel filtrasyon sistemi ile doğrulamak, ii) yüksek seviyeli heptamerize form üretimini optimize etmek, saflaştırmak, karakterize etmek ve iii) proteinleri immünojenisite ve hayvan testleri için incelemektir. Bu nedenle, tüm bu deglikosilasyon ve furin işleme stratejilerini kullanarak, PA83 proteininin in vivo, deglikosile edilmiş, heptamerize formunun, şarbona karşı toplu aşılama için yeni bir potansiyel immünojenik aşı adayı olabileceğini ummaktayız. Ayrıca, deglikosillenmiş PA83'ün heptamer formu, heptamerik yapısı nedeniyle daha stabil olabilmektedir. Çalışma, pandemi döneminde toplu aşılama için önemli olan daha kısa sürede daha güvenli ve ucuz ürünler sağlamak, hedef proteinlerin üretimi için bitki bazlı ekspresyon sistemlerinin umut verici kullanımını da doğrulamaktadır.