Hıyar (Curcuis sativus L.) genotiplerinin önemli hastalıklara dayanıklılık durumlarının moleküler yöntemlerle belirlenmesi ve Double Haploid tekniğinin optimizasyonu

Abstract

Hibrit tohum üretiminde kullanılan saf ebeveyn hatlarının elde edilmesi çok zaman alıcı (6-8 yıl), zahmetli ve masraflıdır. Hıyar ıslah çalışmalarının etkili bir şekilde hızlandırılması için biyoteknolojik teknikleri yeni çözümler sunmaktadır. Bu tekniklerden biri olan doku kültürü (double haploid) yöntemiyle kısa sürede (1-2 yıl) 100% homozigot ebeveyn hatlar elde edilebilmektedir. Double haploid bitki elde etmesinde kullanılan yöntemler parthenogenesis (ışınlanmış polen ile tozlanma ve embriyo kurtarması), androgenesis (Anter veya mikrospor kültürü), ve gynogenesis (ovul veya yumurtalık kültürü)'dür. Yapılan çalışmalara göre hıyardaki haploit bitki elde etme yöntemlerinden gynogenesis daha etkili fakat genotipe bağlıdır. Dolaysıyla her genotip için protokol optimizasyonu gerekmektedir. Bu çalışmada kullandığımız 28 tane genotipte (14 F1 ve 14 saf hat) ovul kültürü yoluyla haploid bitki elde etme protokolünün optimizasyonu ve bu genotiplerin ZYMV, CMV, PRSV hastalıklarına dayanıklılık durumlarını moleküler markırlarla belirlenmesi amaçlanmıştır. Ovül kültürü çalışmalarında üç protokol kullanılmıştır (P1, P2 ve P2K3). P1 protokolünde en yüksek embriyo oluşum oranı %71 (22 nolu genotip), en düşük embriyo oluşum oranı %3 (15 nolu genotip) ve ortalama embriyo oluşum oranı %20'dir. Rejenerasyon (sürgün oluşumu) bakımından en yüksek oran 18 nolu genotiple %140 (ortalama 1.4 sürgün/eksplant), en düşük oran ise 25 nolu genotiple %0,5 bulunmuştur. Ortalama sürgün oluşum oranı %6 bulunmuştur. P1 protokolünde rejenerasyon olmasına rağmen bitki elde edilememiştir.P2 ortamı ile yaptığımız çalışmada en yüksek embriyo oluşum oranı (%75) 3 nolu genotipte bulunmuştur. En düşük embriyo oluşum oranı (%5,8) ise 6 nolu genotipte bulunmuştur. Ortalama embriyo oluşum oranı %20'dir. Sürgün oluşumu bakımından en yüksek oran %4,6 olarak 18 nolu genotipte, en düşük oran ise %0,5 olup 7 nolu genotipte elde edilmiştir. Ortalama rejenerasyon oranı %6'dır. P2 ortamında rejenerasyon elde edilmesine rağmen bitki gelişimi gerçekleşmemiştir. Rejenerantların gelişmesi için optimizasyon gerekmektedir. P2K3 ortamı P2 ortamını modifiye ederek elde edilmiştir. P2K3 protokolünde en yüksek embriyo oluşum oranı %104 (yani 1.04 embriyo/eksplant) olup 4 nolu genotiple elde edilirken en düşük embriyo oluşum oranı % 2,5 olup 2 nolu genotipte bulunmuştur. P2K3 protokolü ile yaptığımız çalışmada ortalama embriyo oluşum oranı %20'dir. Sürgün rejenerasyonu için en yüksek oran %470 (4.7 sürgün/explant) ile 14 nolu genotipte bulunmuştur. En düşük rejenerasyon oranı %1 olarak 12 nolu genotipte elde edilmiştir. Bu rejenerantlardan bitki elde edilebilmiştir. 7 nolu genotipten 3 tane diploid, 11 nolu genotipten 4 tane (hepsi haploid) ve 14 nolu genotipten 11 tane (hepsi diploid) ve 12 nolu genotipten 1 tane (diploid) bitki olmak üzere toplam 19 bitki elde edilmiştir. Kısacası P2K3 protokolüyle 4 haploid ve 15 diploid olmak üzere toplam 19 tane bitki elde edilmiştir. P2K3 protokolünün hıyarda double haploid bitki geliştirme programlarında başarılı bir şekilde uygulamabileceği görülmüştür. Yapılan moleküler testleme çalışmalarında ise kabak sarı mozaik virüsü hastalığı (ZYMV) için CAPS-T86C, hıyar mozaik virüsü hastalığı (CMV) için SSR9-56 ve SSR11-1 papaya halkalı leke virüsü (PRSV) için SSR11-177) markırları kullanarak 28 genotipte optimizasyon yapılarak dayanıklı ve hassas genotipler belirlenmiştir.