Pichia pastoris'te rekombinant bakteriyel alfa milaz üretimi

Abstract

Endüstriyel amilazların en önemli ve sık kullanılan formlarından biri olan α-amilazlar; gıda, ilaç, tekstil, deterjan, biyoyakıt üretimi ve kirli suların arıtılması gibi birçok alanda tercih edilen bir biyokatalizördür. α-amilazlar (α-1,4-glukan-glukanohidrolaz, EC 3.2.1.1), nişasta molekülündeki α-(1,4)-glikozidik bağlarının iç kısımlarına etki ederek nişastanın hidrolizini katalizler. Bunun sonucunda α-amilazlar; glikoz, maltoz, maltotrioz ve α-limit dekstrin gibi; α-konformasyonuna sahip monomerleri ve farklı uzunluktaki polimerleri oluştururlar. α-amilazlar birçok bitki, hayvan, bakteri ve mantarda yaygın olarak bulunmaktadır. Ancak kullanım alanlarında duyulan ihtiyaca bağlı olarak; yüksek verimlilikte enzim üretimi ve endüstriyel koşullarda arzu edilen özelliklere sahip α-amilazların eldesi için rekombinant suşlar tercih edilmektedir. Pichia pastoris (Komagataella phaffii) rekombinant protein üretiminde sıklıkla kullanılan metilotrofik bir mayadır. P. pastoris birçok promotora sahip olmasına rağmen, etanol metabolizmasında sorumlu olan ADH2 (alkol dehidrogenaz) promotoru, yüksek ekspresyon seviyesi nedeniyle dikkat çekmektedir. Bu çalışmada, Bacillus subtilis PY22 α-amilaz geni (AmyE); tam uzunluktaki ve olgun formunu kodlayan dizinin, sentetik ADH2 (ADH2SNT5) promotorunu içeren ekspresyon vektörüne ligasyonu gerçekleştirilmiş ve P. pastoris GS115 suşuna klonlanmıştır. Elde edilen klonlardan, gerçek zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonları (GT-PZR) analizi ile tek kopya olduğu belirlenen; P. pastoris GS115-pADH2SNT5α-α-Amilaz-Full Lenght (FL) ve P. pastoris GS115-pADH2SNT5α-α-Amilaz-Mature (MF) üretim klonları olarak seçilmiştir. FL ve MF klonları, engelli erlende, 96 saat boyunca etanol ile indüklenerek rekombinant protein üretimi gerçekleştirilmiştir. FL ve MF klonunun en yüksek α-amilaz aktiviteleri sırasıyla 74.2±0.94 U/ml ve 215±3.18 U/ml olarak hesaplanmıştır. FL ve MF klonlarının üretimi arasında yaklaşık 3 kat fark olması nedeni ile büyük ölçekli üretim için uygun olan klon MF klonu olarak seçilmiştir. MF klonu, 5 L hacimli biyoreaktörde, 28°C, pH 6.0 ve normoksik koşullarda (çözünür oksijen oranı %20), sabit µ (µ: 0.028 sa-1) stratejisine uygun şekilde etanol ile indüklenerek 90 saat süresince α-amilaz üretimi gerçekleştirilmiştir. MF klonunun büyük ölçekli üretimi sonucunda α-amilaz enzimi zamana bağlı olarak artış göstermiş ve en yüksek α-amilaz aktivitesi 90. saatte 2219±52.18 U/ml (1403 U/mg) olarak hesaplanmıştır. Engelli erlen ile biyoreaktör üretimi karşılaştırıldığında α-amilaz enziminin yaklaşık 10 kat arttığı gözlenmiştir. Rekombinant α-amilaz enziminin karakterizasyonu gerçekleştirilmiş ve SDS-PAGE analizi sonucu proteinin moleküler ağırlığının yaklaşık 80 kDa boyutlarında olduğu saptanmıştır. Enzimin optimum çalışma koşulları 60°C sıcaklık ve pH 7.0 olarak belirlenmiştir. α-amilazın, 1 saat süresince farklı sıcaklıklarda inkübe edilmesi sonucunda, 50°C'de %81 ve 60°C'de %65 aktivitenin korunduğu tespit edilmiştir. Enzim aktivitesi 1 saat sonunda pH 6.0-7.5 değerleri arasında %80'nin üzerinde stabil kalmıştır. 10 mM konsantrasyonundaki Ca2+ ve Mg2+ iyonları enzim aktivitesini artırırken, aynı konsantrasyondaki Fe2+, Zn2+ ve Cu2+ iyonları aktiviteyi düşürmüştür. Bu çalışma sonucunda, rekombinant bakteriyel kaynaklı α-amilaz enziminin, P. pastoris ekspresyon sisteminde güçlü ve alternatif olarak kullanılabilecek ADH2 promotorunun kontrolünde, büyük ölçekli üretimde, başarıyla ifade edildiği saptanmıştır.