Pro-inflamatuvar sitokin makrofaj migrasyonu inhibe faktör (MIF)’ün ilişkide olduğu proteinlerin tanımlanması ve bunların moleküler özelliklerinin belirlenmesi

Abstract

Makrofaj göçünü (migrasyonunu) engelleyici faktör (MIF) birçok hücre tipi tarafından sentezlenen ve ismi insan monositlerinin göçünü engellemesi nedeniyle verilmiş olan bir immun mediatördür. Son yıllarda, MIF'in Jab1/CSN5 (c-Jun-aktive edici domain-bağlayıcı protein 1)'e bağlanarak, COP9 (constitutive photomorphogenesis: sürekli ışıkla değişim 9) signalozomun (CSN) denedilaz (Cullin proteininden Nedd8 proteinin uzaklaştırılması) aktivitesini durdurduğu ortaya konulmuştur. CSN'nin hedef proteinlerinden biri Cullin'dir ve Cullin proteini SCF (Skp1-Cullin-F box) E3 übikütin ligaz ailesine aittir. SCF E3 übikütin ligazlar, 26S protazomda yıkıma uğratılan substratların übikütinlenmesinden sorumludurlar. Bu nedenle, übikütinlenmeden sorumlu enzimler ve protazom, übikütin protazom sistemi (UPS)'ne ait önemli iki elemandır. MIF'in UPS'deki biyolojik rolünü daha iyi anlamak amacıyla, bu çalışmada MIF'i sürekli olarak ekspre eden NIH3T3 (fare fibroblast hücre dizisi) hücrelerinde biyotinlenmiş MIF ile ilişkide olan proteinleri araştırdıkBiyotinlenmiş MIF ve onun ilişkide olduğu proteinler, streptavidin ile saflaştırıldı. MIF'e bağlanan proteinlerin kütle spektrometrisi ile tanımlanması sonucu, MIF ile birlikte peroksiredoksin 1 ve RP S19 (ribozomal protein S19) gibi MIF'e bağlandığı bilinen proteinlerin de belirlenmesi kullandığımız metodun güvenilirliğini gösterdi. Belirlenen yeni proteinler yanında Valosin-içeren protein (valosin-containing protein, VCP) gibi endoplasmik retikulum (ER)'la ilişkili ve UPS'de çalışan proteinler de saptandı. Belirlenen proteinlerin büyük bir çoğunluğunun UPS'de görevli olduğunun bulunması, bundan sonraki araştırmaların MIF ile VCP arasındaki ilişki üzerine yoğunlaşmasına neden oldu. MIF'in VCP'ye Jab1/CSN5 aracılı bağlandığı, VCP ve Jab1/CSN5 arasındaki bağlanmanın ise direk olduğu protein-protein bağlanmasını belirlemede kullanılan birlikte immun çökeltme (ko-immunopresipitasyon), in vitro çökeltme (in vitro presipitasyon) ve floresan rezonans enerji transferi (FRET) yöntemleriyle kanıtlandıVCP ve Jab1/CSN5 arasındaki bağlanma, her iki proteine ait mutant ve vahşi tip proteinlerin hücreye transfeksiyonu ve sonra da onların immun çökertmeleri ile belirlendi. Jab1/CSN5'in MPN (Mpr1 Pad1-N-terminal) domainin, VCP'nin ND1 domaini ile bağlandığı belirlendi. Ayrıca, bağlanmanın izopeptidaz aktivitesine sahip MPN domainindeki JAMM (Jab1/MPN domain-associated metalloisopeptidase: Jab1/MPN domain-ilişkili metaloizopeptidaz) motifine bağlı olmadığı da gösterildiJel filtrasyon kromatografisi kullanılarak da, VCP'nin sadece Jab1/CSN5'a değil de tüm CSN kompleksine bağlandığı ortaya konulduRNA interferans aracılı gen susturma (nakdavn: gen ekspresyonunun azaltılması) çalışmaları ile, Jab1/CSN5'ın JAMM motifinin, CSN kompleksi subunitelerinin ve CSN'e bağlı deübikütinlaz USP15 (ubikütin spesifik proteaz 15)'in VCP'ye bağlı substratların deübikütinlenmesi (übikütin zincirlerinin uzaklaştırılması) için gerekli oldukları gösterildiKısacası, bu sonuçlar, VCP'nin CSN ile birlikte bir kompleks oluşturduğunu ortaya çıkardı. Bu kompleksin görevi ise, übikütinlenmiş ve yanlış katlanma gösteren proteinlerin kaderlerini belirlemede görev yaparak, bu proteinleri bağlı bulundukları komplekslerden uzaklaştırmaktır. CSN'e, Jab1/CSN5 aracılı bağlanan MIF ise, Jab1/CSN5 aktivitesini baskılayarak, VCP-CSN kompleksinin görevini engellemektedir.