Pichia pastoris mayasında GAP promotoru altında deve kimozini ekspresyonu

Abstract

Kimozin rennin olarak adlandırılan bir aspartik proteazdır. Kimozin süt endüstrisinde peynir yapımında kullanılan başlıca enzimdir. Bu enzim memelilerin şirdeninden salgılanır ve sütü pıhtılaştırma özelliği bulunmaktadır. Günümüzde ticari kimozin dört farklı kaynaktan elde edilmektedir. Bunlar hayvansal, bitkisel, mikrobiyal ve rekombinant üretimle elde edilmektedir. Hayvansal kimozini geleneksel olarak sütten kesilmemiş buzağıların abomasumundan elde edilmektedir. Küçük yaşta buzağıların kesilmesi ve dünyada gittikçe artan talep karşısında bu endüstrinin yetersiz kalmasından dolayı, alternatif bitkisel, mikrobiyel ve rekombinant kaynağa yönelim artmıştır. Pichia pastoris rekombinant protein üretiminde çoğunlukla tercih edilen bir eskpresyon sistemidir. Heterolog protein üretiminde P. pastoris mayası yüksek verim elde edilebilmektedir. P. pastoris birçok promotora sahip olmasına rağmen en sık kullanılan AOX1 ve GAP promotorlarıdır. GAP promotoru; P. pastoris gliseraldehit -3 fosfat dehidrojenaz geninin ekspresyonundan sorumlu bölgedir ve yapısal bir promotordur Bu araştırmada deve kimozin geni metilotrofik bir maya olan P. pastoris mayasında GAP promotoru kontrolünde pGAPZαA üretim vektörü kullanılarak üretilmiştir. Elektroporasyon ile gen aktarımı yapılan P. pastoris X33 suşlarında bulunan vektör kopya sayısı Southern Blott analizi ile belirlenmiştir. Seçilen tek kopya suşu ile çalkalamalı erlen koşullarında uygun pH (3-7) ve sıcaklık (20-28 oC) aralıkları faktöriyel deneme deseni ile 3 paralel ve 2 tekerrür ile belirlenmiştir. İstatik analizleri sonucunda optimum sıcaklığın 24 ve pH 'ın 3 olduğu belirlenmiştir. Büyük ölçekli (5-L) kimozin üretimi pH 3.0 ve 24 oC ' de gerçekleştirilmiştir. Fermantasyonun üretim aşaması GAP promotorunun verimli olduğu hipoksik şartlarda 103 saat boyunca sürdürülmüştür. En yüksek enzim aktivitesine 56. saatte ulaşılmış ilerleyen saatlerde enzim aktivitesinde azalma olduğu gözlenmiştir. Rekombinant kimozin aktivitesi yaklaşık olarak 20 IMCU/mL diğer bir ifade ile 2000 Soxhelet Unıt/mL bulunmuştur. Fermantasyon ortamında toplam 214.7 mg/L rekombinant protein olduğu tespit edilmiştir. SDS-PAGE analizi sonucunda yaklaşık 42kDa büyüklüğünde bir bant olarak gözlenmiştir. Enzimin optimum çalışma sıcaklığı 50 oC, optimum pH'sı 3.0-4.0 arası olduğu belirlenmiştir. Enzim pH 3.0-6.5 arası ve 20-65 oC arası stabilitesini 2 saat koruyabilmektedir. Fakat pH' nın 4 ve sıcaklığın ise 50 oC üzerine çıkması ile enzim i aktivitesinin azalmasına neden olmaktadır. Ayrıca enzim 10 Mm Mg+2 ve Fe+2 varlığında aktivitesi sırası ile %129.58 ve % 72.5 artarken; Cu+2, Zn +2 varlığında inhibe olmaktadır. Deve kimozini en yüksek aktiviteyi 20-40 Mm CaCl2 arasında ulaşmışken, bu konsantrasyonun artması ile aktivitesi düşmektedir. Üretilen rekombinat deve kimozini ile beyaz peynir üretimi gerçekleştirilmiş, üretim sonucunda ticari rekombinant sığır ile rekombinant deve kimozini verimleri kıyaslanmıştır. Ticari kimozin ile üretilen beyaz peynir verimi %14.8 iken; rekombinant kimozin verimi %15.45 bulunmuştur. Bu sonuçlara göre rekombinant deve kimozinin ticari rennet kadar etkili bir enzim olduğu saptanmıştır. Rekombinant deve kimozin enziminin üretim şartlarının optimizasyonu ile verimin arttırılması ve ölçek büyütme çalışmaları gerçekleştirildiği takdirde ticari olarak üretim potansiyeli bulunmaktadır.