Mısır (Zea mays L.) bitkisinde DNA metilasyonu ve heterosis ilişkileri üzerine bir araştırma

Abstract

DNA'da dizi değişimi olmaksızın gen anlatımı ve fonksiyonundaki kalıtsal değişimler epigenetik olarak tanımlanmaktadır. DNA metilasyonu, epigenetik düzenlemeler arasında en iyi ve yaygın olarak çalışılmış olan mekanizmadır. Bitkilerde en yaygın DNA metilasyonu sitozin bazında gerçekleştiği için metil sitozin beşinci baz olarak adlandırılmaktadır. Sitozin metilasyonu, organizmalarda bir çok epigenetik fonksiyonla ilgilidir. Epigenetik regülasyonun içsel ve dışsal biyo-savunma, heterosis, vernelizasyon, çiçeklenme ve plastisiti ile ilgili olduğu bilinmektedir. Bu doktora tez çalışmasının amaçları: (i) iki kendilenmiş mısır hattı (Zea mays L.) ve bu hatların melezlenmesiyle elde edilen hibridi arasında DNA sitozin metilasyon düzeylerinin araştırılması, (ii) 5-azasitidin (5-azaC) ve tuz (NaCl) uygulamalarıyla ebeveyn ve hibridin DNA sitozin seviyesindeki değişimleri karşılaştırılması, (iii) DNA sitozin metilasyonunun heterosis üzerine etkilerinin araştırılmasıdır. Bu çalışmada distile su, 150 mM NaCl ve 1.5 mM 5-azaC uygulamaları kullanılmıştır. Uygulamalar olgun mısır tohumları üzerine yapılmış ve analizler ise 6 günlük fidelerde gerçekleştirilmiştir. Çalışmada ebeveyn hatlar olarak kendilenmiş hatlar [Mo17 (♀) ve B73 (♂)] kullanılmıştır. Heterosis çalışmaları için ayrıca bu ebeveynler melezlenmiş ve F1 hibriti [Mo17xB73] elde edilmiştir. Çalışmada bisülfit sekanslama (BiSeq) yöntemiyle 5 lokus, Gen Spesifik-Metilasyon Duyarlı Çoğaltım Polimorfizm (GS-MSAP) yöntemiyle tekli (unipleks), ikili (dupleks) ve çoklu (multipleks) olmak üzere 18 lokus, Metilasyon Duyarlı Kesilmiş Üniversal Uzunluk Polimorfizm (MS-CULP) yöntemiyle 16 lokus, ve Metilasyon Duyarlı Rastlantısal Çoğaltım Uzunluk Polimorfizm (MS-CRALP) yöntemiyle 4 lokus olmak üzere toplamda 36 lokus çalışılmıştır. Bu çalışmada BiSeq çalışmaları, çalışılan lokusların çoğunun, kendilenmiş mısır hatlarının olgun tohumları arasında hipo veya hiper-metilasyon göstermediğini açıkça ortaya koymuştur. BiSeq çalışmalarında kullanılan lokuslar arasındaki düşük metilasyon farklılıkların belirlenmiş olması nedeniyle, 6 günlük fidelerin BiSeq metodu kullanılarak araştırılmamıştır. Elde ettiğimiz sonuçlara dayanarak, BiSeq yöntemini kullanan daha ileri çalışmaların DNA sitozin metilasyonu ve heterosis arasındaki ilişkilerle ilgili daha fazla bilgi ortaya koyacağı görülmüştür. GS-MSAP yöntemi, tuz ve demetilasyon ajanı olan 5-azaC ile muamele edilmiş Mo17, B73 ve Mo17xB73 arasında metilasyon farklılıkları gösteren epialleller belirlemiştir. Çoklu GS-MSAP lokusları, DNA sitozin metilasyonu hakkında bazı değerli bilgiler ortaya koymuştur. Ayrıca, sonuçlarımız MS-CULP yöntemi kullanılarak çalışılan bazı lokuslarının Mo17, B73 ve Mo17xB73 arasında metilasyon farklılıkları sunduğunu göstermiştir. Öte yandan, MS-CRALP lokuslarının hiçbiri çalışılan bitki örnekleri arasındaki metilasyon farklarını ortaya koymamıştır. Heterosis, tarımda ve bitki ıslahında son derece önemli bir olgudur. Bu çalışmada Mo17 ve B73 hatlarının arasında melezlemeler yapılarak F1 melez bireyler oluşturmuştur. Melez bitkilerin yüz tohum ağırlığı, her iki ebeveynin de (% 38.18) çok üstünde olup heterosis göstermiştir. 5-azaC ve NaCl'nin etkileri, hibrit ve kendilenmiş ebeveyn hatları arasında farklılık göstermiştir. Sonuçta, hibrid bireylerde (heterosis durumunda) NaCl uygulamasının büyümeyi ve gelişmeyi olumlu yönde etkilediğini, 5-azaC uygulamasının ise heterosiste olumsuz etkilediğini ortaya koymuştur. Diğer yandan, bulgular 5-azaC uygulamasının heterosis üzerine NaCl uygulamasından daha fazla olumsuz etkisi olduğunu göstermiştir. Bu, heterosis üzerindeki DNA sitozin metilasyonunun bir göstergesi olarak kabul edilmiştir. Sonuç olarak, bu çalışmada olgun tohumlarda ve NaCl ve 5-azaC ile muamele edilmiş 6 günlük fidelerde belirli seviyelerde DNA metilasyon farklılıkları olduğunu gözlemledik. Bu çalışma sırasında karşılaşılan bazı sınırlamalar nedeniyle, bu tezin bazı amaçları etkili bir şekilde yerine getirilememiştir. Özellikle mısır ebeveynlerinden birindeki genetik karışım, melezler ve fideler arasında ölçüm farklılıklarına neden olmuştur. Ayrıca, BiSeq yönteminde kullanılan lokusların sayısı çok düşüktür. Ebeveynler ile melez arasındaki farkları ve DNA sitozin metilasyonunun heterosis üzerine etkilerini ortaya çıkarmak için, birden fazla yöntem, birden fazla NaCl ve 5-azaC doz uygulamaları ve daha fazla lokus kullanılmalıdır. Daha iyi ve bilimsel sonuçların alınması için Bütün Genom Bisülfit Sekanslama (WGBS) yöntemi kullanılarak yapılması önerilmiştir.