Erkek sıçan (Rattus norvegicus) böbrek prolaktin reseptör mRNA çeşitliliğinin belirlenmesi

Abstract

Prolaktin reseptörü (PRLR) ve onunla ilişkili prolaktin hormonu (PRL), çoğunlukla laktasyon ve üreme ile ilgili fonksiyonları ile tanınmakla birlikte, omurgalılarda; ozmoregülasyon, proliferasyon, immünoregülasyon ve davranışında içinde bulunduğu 300'den fazla fonksiyon ile ilişkilendirilmiştir. Sıçan PRLR geni (s-prlr) yaklaşık 190 kbç büyüklüğünde olup, en az iki farklı mRNA ve bunların ürünleri olan uzun ve kısa form (UF ve KF) olarak adlandırılmış iki farklı protein kodlamaktadır. PRLR'nin insanda 11, farede 4, domuz ve sıçanda ise 2 varyantı bilinmektedir. Bu varyantlar, ya mRNA'nın 3' ucunun farklı ekzonlar ile sonlanması (ekzon 10 veya 11, sıçan UF ve KF'de olduğu gibi) ya da 'iç ekzonların' (ekzon 3 ile 9 arası) bir ya da bir kaçının çıkarılması sonucu oluşmaktadır. Fare prlr geni ve ürünü olan mRNA'ları 3' ucu ekzonları ile farklılık gösteren bir uzun (ekzon 10) ve üç kısa form (ekzon 11, 12 ve 13) prolaktin reseptörü kodlamaktadır. Bu çalışmanın amacı sık kullanılan bir model organizma olan sıçanda (Rattus norvegicus) olası yeni PRLR varyantlarının araştırılması ve 3' UTR bölgelerinin aydınlatılması olmuştur. Bu amaç doğrultusunda, ilk olarak 'iç ekzon' ve '3' ucu' varyantları aranmıştır. Bunu takiben, farede varlığı bilinen (ekzon 11 ve 12) ancak sıçanda ifade edilip edilmediği bilinmeyen ekzon varyantlarının varlığı araştırılmıştır. Son olarak da, sıçan PRLR UF ve KF'nin 3' ifade edilmeyen bölgelerinin (3' UTR) dizilerinin açığa çıkarılması hedeflenmiştir. İç ekzon ve 3' ucu varyantlarının aranması için protein kodlayan ekzonları hedef alan primer çiftleri sıçan prlr geni referans alınarak tasarlanmıştır. Farede ifade edilen (ekzon 11 ve 12) ancak sıçanda bilinmeyen bu ekzonların homologları sıçan ve diğer kemirgen prlr genlerinde araştırılmış ve sıçanda yüksek bir homoloji ile korunduğu bulunmuştur. Bu bilgi doğrultusunda, yine sıçan prlr gen dizisi referans alınarak bu olası ekzonlara özgü primerler tasarlanmıştır. Sıçan PRLR varyantlarının 3' UTR dizilerinin aydınlatılması içinde, hem 3' UTR bölgelerini 1hem de bu mRNA'ların poli (A) kuyruklarını hedef alan primer setleri tasarlanmıştır. Bu amaçların gerçekleştirilmesi için erkek ve dişi sıçan böbrek, karaciğer ve testislerinden toplam RNA ve mRNA izolasyonları yapılmıştır. Bu RNA'lardan rivörz transkriptaz reaksiyonu (RT-PCR) ile ilk iplik cDNA sentezi gerçekleştirilmiş ve devamında da çeşitli PCR yaklaşımları ile (3' RACE, Nested PCR ve Stepdown PCR) istenen bölgenin çoğaltılması hedeflenmiştir. Elde edilen amplifikasyon ürünlerinin baz dizilemesi hizmet alımı ile gerçekleştirilmiştir. 3' ve iç ekzon varyantlarının aranması için gerçekleştirilen reaksiyonlar sonucunda sıçan PRLR UF ve KF'nin çoğaltılması gerçekleştirilmiş ancak bu formların ekzon 10 veya 11 varyantlarına ya da ekzon 3 ile 9 arası varyantlarına rastlanmamıştır. Farede protein kodlayan (ekzon 11 ve 12) ve sıçanda da yüksek homoloji ile korunduğu ortaya konan bu ekzonlara yönelik tasarlanan primerler ile PCR reaksiyonları gerçekleştirilmiş ancak bu bölgelerin ifade edildiğine yönelik bir bulguya rastlanmamıştır. Analiz edilen sıçan böbrek, karaciğer ve testislerinde; sıçan PRLR 3' ve iç ekzon varyantlarının bulunmadığını göstermektedir. Bu bilgiler ışığında daha önceki yapılan çalışmalarda Northen Blot yöntemi ile farklı boyutlarda elde edilen sıçan PRLR mRNA'larının hepsinin uzun ve kısa forma ait olduğu ve bu yüksek boyut farkının önemli bir kısmının 3' UTR'lerinden kaynaklandığı sonucuna varılmıştır. Sıçan PRLR varyantlarının 3' UTR'lerin aydınlatılmasına yönelik gerçekleştirilen reaksiyonlar, kısa formun yaklaşık 501-505 bç'lik bir 3' UTR bölgesine sahip olduğunu ve uzun formunda iki farklı 3' UTR bölgesine sahip olabileceğini işaret etmiştir. Bu formun 3' UTR bölgelerinden birinin yaklaşık 2000 bç'lik dizisi aydınlatılmıştır. Sunulan tez projesinin kapsamı, sıçan erkek böbreği ile sınırlandırılmış olsa da, bu tez çalışmasında erkek ve dişi sıçanların böbrek, karaciğer ve testisleri yeni PRLR varyantlarının tanımlanması için kullanılmıştır. Çalışılan her iki cinsiyet ve tüm organlarda PRLR uzun ve kısa formun varlığı başarı ile gösterilmiş ancak bunların yeni 3' veya iç ekzon varyantlarına rastlanmamıştır. Fareye özgü varyantları kodlayan ekzonların bazı kemirgenlerde, özellikle sıçanda iyi korunmuş olduğu görülmüşse de, bu ekzonların sıçan karaciğer, böbrek ya da testisinde ifade edildiğine dair bir ip ucuna rastlanmamıştır.