STZ-İndüklenmiş diyabetik fare ovaryumunda endoplazmik retikulum stresi (ERS) ilişkili protein ekspresyonlarının değerlendirilmesi

Abstract

Hücre organellerinden biri olan endoplazmik retikulumun (ER) başlıca görevi; yeni oluşan sekretuvar ve membran proteinlerin olgunlaşmasını ve tersiyer yapılarda doğru katlanmalarını sağlamaktır. N-bağımlı glikozilasyon inhibisyonu, kalsiyum dengesinin bozulması, hipoksi, oksidatif stres, glukoz yoksunluğu, viral enfeksiyonlar ve ortamın sıcaklığı gibi çevresel koşullar, yanlış katlanmış ya da katlanmamış proteinlerin ER lümeninde birikmesine yol açarak ER stresi (ERS) adı verilen olayı meydana getirir. ERS'ye cevap olarak hücrede dengeyi yeniden sağlamak için katlanmamış protein cevabı (Unfolded Protein Response, UPR) adı verilen sinyal yolağı aktif hale gelir. UPR veya ERS cevabının çeşitli fizyolojik durumlara karşı etkili bir adaptasyon mekanizması olduğu bilinmekle birlikte diabetes mellitus gibi hastalıkların fizyopatolojisi ile ilişkisi olduğu bildirilmiştir. Diyabetle indüklenmiş hiperglisemi ya da glukoz emilimindeki yetersizliğin fare granuloza hücrelerinin apoptozuna yol açtığı ve oositlerde; mayozun ilerlemesini azalttığı, düşük oosit kalitesine neden olduğu bilinmektedir. Hiperglisemik koşulların fare ovaryumlarında yarattığı olumsuz sonuçların nedenleri arasında, bozulan protein sentez mekanizması, ERS'nin ve buna cevap olarak ortaya çıkan hücre kaderini belirleyen UPR mekanizmasının rolleri olabilir. Çalışmamızda, 24 günlük toplam 31 adet BalbC ırkı dişi fare kullanılarak üç grup oluşturuldu: 1) kontrol grubu (herhangi bir uygulama yapılmayan grup) (n=10), 2) çözgen grubu (intra peritonel (i.p) 100 µl sodyum sitrat enjekte edilen grup) (n=6), 3) diyabet grubu (n=15) (tek doz 90 mg/kg streptozotosinin (STZ) i.p. olarak enjekte edilen grup). Diyabet modelinin takibi için, STZ enjeksiyonu takiben 2. , 7. ve 14. günlerde kan şekerleri ölçüldü. Kan şekeri değeri 300 mg/dl'nin üzerinde çıkan dişiler diyabetik kabul edildi. 14 günlük takip süresinin sonunda dişiler sakrifiye edilerek ovaryum örneklerinde ERS proteinlerinin (GRP78, DDIT3, KASPAZ 12 ve p-PERK) lokalizasyonları ve ekspresyon seviyelerini göstermek amacıyla immünohistokimya ve western blot yöntemleri uygulandı. qRT-PCR yöntemi ile ERS belirteçleri olan Grp78 ve Ddit3 genlerine ait mRNA ekspresyon seviyeleri incelendi. Diyabet grubuna ait ovaryum örneklerinde p-PERK ve DDIT3 proteinlerinin immün boyanmaları kontrol ve çözgen gruplarına kıyasla anlamlı olarak arttığı gözlendi. Her iki proteininde immün boyanmaları özellikle atretik foliküllerde, apoptotik granüloza hücrelerinde ve dejenere ovositlerde görüldü. Ovaryumlarda p-PERK, GRP78 ve Kaspaz 12 protein miktarı açısından gruplar arasında anlamlı farklılık olmadığı belirlendi. Grp78 mRNA düzeyi gruplar arasında anlamlı bir farklılık göstermemiştir. Ddit3'ün mRNA miktarı diyabetik gruplarda anlamlı olarak artarken protein düzeyinde gruplar arası herhangi bir farklılık gözlenmemiştir. XBP1s protein miktarının ise diyabetik ovaryumlarda arttığı gözlenmiştir. Sonuç olarak; diyabetin fare ovaryumlarında ERS'yi başlatarak UPR'yi tetiklediği tespit edilmiştir.