Kültüre edilmiş meme kanseri hücrelerinde ATM, TRIM29, TWIST1 ifadesini kontrol eden moleküler mekanizmaların araştırılması

Abstract

Meme kanseri kadınlarda en sık rastlanan kanser türüdür. Meme kanseri toplam kanser vakalarının %23'ünü ve kanserin neden olduğu ölümlerin %14'ünü oluşturur.Kanserli hücrelerin oluşum süreci ve mekanizmaları çok komplekstir. Kanserle bağlantılı olan genlerin ekspresyonu ve kontrolünün nasıl sağlandığını anlamaya yönelik birçok çalışma yapılmaktadır. Kanserin oluşum mekanizmalarının anlaşılması kanser tedavisi için farklı yöntemler geliştirilmesine yardımcı olacaktır. Kanser tedavisinde günümüzde en önemli nokta erken teşhis ve çok yönlü tedavidir. Artık insanların gen haritaları çıkarılmakta ve gelecekteki kanser yatkınlık oranları test edilmektedir. Bu çalışmanın temel amacı gelecekte meme kanseri marker geni olmaya aday ATM'nin, tümör baskılayıcı gen olduğunu düşündüğümüz TRIM29 ve TWIST1 onkogeni arasındaki transkripsiyonel bağlantıların meme kanseri ve meme epiteli hücre gruplarında belirlenmesidir. Çalışma kapsamında ilk olarak ATM ve TRIM29 arasındaki transkripsiyonel ilişkinin gösterilmesi hedeflenmiştir. Bu sebeplelaboratuvarda bulunan 9 farklı meme epiteli hücre hattında TRIM29 ekspresyonu test edilmiştir. Bu hücrelerden 7 tanesi meme kanseri, 1 tanesi normal meme epiteli hücresi ve 1 tanesi ölümsüz meme epiteli hücre hattıdır. 4 hücre hattının TRIM29 ekspresyonunasahip olduğu belirlenmiştir. TRIM29 ekspresyonu2 meme kanseri hücre hattı (SKBr3, MDA-MB-468), 1 normal meme epiteli hücresi (HMEC) ve kanser oluşturma yeteneği olmayan MCF-10A hücrelerinde tespit edilmiştir. SKBr3, MDA-MB-468 ve HMEC hücreleri çalışma kapsamında kültüre edilmiştir. 2 adet TRIM29 eksprese etmeyen hücre grubu (BT-549 ve MDA-MB-231) da çalışma boyunca kontrol grubu olarak kullanılmıştır. Bu hücre gruplarından SKBr3, MDA-MB-468, MDA-MB-231 ve HMEC için shRNA aracılı,ATMinaktivasyonu sağlanmış hücreler elde edildi. SKBr3, MDA-MB-468 ve HMEC hücreleri için ATM azalışını takiben TRIM29 protein ve mRNAekspresyonunda azalma, TWIST1 protein ve mRNA ekspresyonunda ise artma olduğu tespit edildi. Daha sonra ATM tarafından kontrol edilen transkripsiyon faktörleri belirlendi. Bu transkripsiyon faktörleriNF-B, HIF-1α, Sp1 ve ATF'dir. SKBr3, MDA-MB-468, MDA-MB-231 ve HMEC için NF-Bve HIF-1αinaktivasyonu sağlanmışhücreler elde edildi. HIF-1αekspresyonu azaltılmış hücre gruplarında TRIM29 ve TWIST1ekspresyonu test edildi.NF-Binaktivasyonu sağlanmış hücre gruplarında ise HIF-1αve TRIM29 ekspresyonu değişimi analiz edildi.Bu iki gendeki azalmanın TRIM29 protein ve mRNA ekspresyonunu azalttığı tespit edildi.Buna karşılık HIF-1αinaktivasyonunu takiben TWIST1 mRNA ve protein ekspresyonunda artma tespit edildi. TWIST1 mRNA ve protein ekspresyonu ATM inaktivasyonu sağlanmış MDA-MB-231 hücrelerinde değişime uğramazken, TWIST1 mRNA ekspresyonu HIF-1α inaktivasyonu sağlanmış MDA-MB-231 hücrelerinde azaldı.Gen inaktivasyonlarının hedef genler üzerine etkisi RT-PCR, eş zamanlı qRT-PCR ve western-blot yöntemleri ile analiz edildi. HIF-1αartışının TRIM29 ekspresyonunu nasıl etkilediğini test etmek için SKBr3, MDA-MB-468 ve HMEC hücreleri hipoksiye maruz bırakılmıştır. Hipoksik koşullar altında, HIF-1αekspresyonundaki artışı takiben TRIM29 ve TWIST ekspresyonu değişimitest edilmiştir. MDA-MB-231 ve BT-549 hücreleri hipoksiye maruz bırakılarak TWIST1 ekspresyonu değişimi analiz edilmiştir. TRIM29 mRNA ve protein ekspresyonunun hipoksik koşullarda SKBr3, MDA-MB-468 ve HMEC hücrelerinde arttığı gözlenmiştir. TWIST1 mRNA ve protein ekspresyonu hipoksik koşullarda TRIM29 ifade eden hücrelerde değişmediği belirlenmiştir. MDA-MB-231 ve BT-549 hücrelerinde ise hipoksik koşullarda TWIST1 mRNA ve protein ekspresyonu artmıştır. Hipoksik koşullarda TRIM29 ekspresyonunun arttığı anlaşılmıştır.Daha sonra ATM ve HIF-1α inaktivasyonu sağlanmış SKBr3 ve MDA-MB-468 hücreleri hipoksiye maruz bırakılmış ve TRIM29 ekspresyonu değişimi analiz edilmiştir. TRIM29'un hipoksik koşullarda ekspresyon artışının ATM ve HIF-1α bağımlı olduğu gösterilmiştir. SKBr3, MDA-MB-468 ve HMEC hücre grupları içinTRIM29 ve TWIST1 ekspresyonu azaltılmış hücreler oluşturulmuş ve genlerin etkileşimi test edilmiştir. TRIM29 ile TWIST1 arasında antagonist bir etkinin olduğu tespit edilmiştir. Meme kanseri ve meme epiteli hücrelerindeTRIM29 ekspresyonu düşüşünü takiben TWIST1 ekspresyonu artmakta, TWIST1 ekspresyonundaki düşüş ise TRIM29 ekspresyonunu artırmaktadır.