Sentrometrik Histone 3 (CENH3) proteininin evrimsel değişimi, türleşmeye olan etkisi ve haploid tetikleme potansiyelinin S. lycopersicum türünde belirlenmesi

Abstract

Literatürde, bir histon 3 varyantı olan sentromerik histon 3'ün (CenH3) yapısında gerçekleştirilen mutasyonlar sonucu farklı türlerde (mısır ve fare kulağı teresi) haploid tetikleyici hatların geliştirilebildiğine yönelik raporlar yer almaktadır. Bu çalışmalarda, hali hazırda var olan CenH3 "null-mutant" hattı veya RNA-interferans tekniği ile susturulmuş CenH3 proteinine sahip bitkiler, N-terminal kuyruğu değiştirilmiş veya tek nokta mutasyonları taşıyan CenH3 proteini ile kurtarılmıştır. Elde edilen T1 jenerasyonundaki bitkiler yabani türler ile melezlendiğinde ise haploid bitkilerin oluştuğu tespit edilmiştir. Bu tez çalışmasında üst paragrafta bahsedilen yöntem ekonomik değeri yüksek bir ürün olan domates için uygulanmıştır. Domates sahip olduğu ekonomik ve fonksiyonel önem nedeniyle haploid çalışmalarından üst düzeyde fayda sağlayabilecek bir ürün olmasına rağmen literatürde bu ürüne yönelik, yüksek başarıya sahip bir haploid bitki elde etme yöntemi henüz gösterilememiştir. Yöntemin başarısı domatesin sahip olduğu doğal CenH3 geninin susturulmasına bağlıdır. Bu tez çalışmasında literatürde kullanılan susturma yöntemlerin aksine, özgün olarak CRISPR-Cas9 gen düzenleme teknolojisi kullanılarak domatese ait doğal CenH3 geni devre dışı bırakılması planlanmış, oluşacak CenH3 "null-mutant" bitkilerin literatürde yer alan raporlardan ve tez kapsamında gerçekleştirilen biyoinformatik çalışmalardan elde edilen bilgilerin yorumlanması sonucu tasarlanmış sentetik genler ile kurtarılması amaçlanmıştır. Tasarlanan sentetik genler, kılavuz RNA'lar ve Cas9 Agrobacterium tumefaciens EHA105 ve AGL1 suşları kullanılarak domatese aktarılmıştır. Moleküler, biyoteknolojik ve doku kültürü çalışmaları sonucu elde edilen transgenik bitkiler, aktarılan genleri taşımaları bakımından test edilmiştir. Test sonucu pozitif bitkiler, gen düzenlenmesinin karakterizasyonu için sekanslanmıştır. Gerçekleştirilen kapsamlı çalışmalar sonucu çok sayıda transgenik bitki elde edilmiş; ancak sadece bir bitki de (B39), hem sentetik gen hem de Cas9 sistemi tespit edilmiştir. Bu bitkiye yönelik yapılan karakterizasyon sonucu bir allelde çerçeve kayması mutasyonu, diğer allelde ise -3 delesyona bağlı tek bir amino asit kaybı tespit edilmiştir. Bu koşullarda mutant bitkiden elde edilmiş T1 jenerasyonunda haploid tetikleyici etki gözlenmemiştir. Çalışmadan elde edilen sonuçların, gelecekte bu alanda yapılacak çalışmalara ışık olması ümit edilmektedir.