Farklı besiyeri bileşimleri ve fermentasyon stratejileri kullanılarak mikrobiyal poligalakturonaz üretiminin optimizasyonu

Abstract

Üretim maliyetlerini düşürmek amacıyla fermentasyon ortamında düşük maliyetli materyallerin kullanımı son yıllarda araştırmacılar tarafından benimsenen bir yaklaşım olmuştur. Bu çalışmada Aspergillus sojae ile poligalakturonaz enzimi üretiminde 11 farklı karbon kaynağı ve 9 farklı azot kaynağı denenmiş olup en verimli seçilenler ile biyoreaktör denemeleri gerçekleştirilmiştir. Fermentasyon ortamındaki aşırı fungal gelişimin kontrolü için mikropartikül tekniği kullanılmış ve tüm denemelerde tekrar edilebilir sonuçlar elde edilmiştir. Küçük ölçekli (5-L) biyoreaktörde substrat miktarı ile hava akış hızı Merkezi Kompozit Tasarımı kullanılarak en yüksek enzim aktivitesi için optimize edilmiştir. Bu amaçla, optimum koşullarda (54.14 g/L substrat miktarı, 0.25 vvm havalandırma hızı) gerçekleştirilen fermentasyonlar için en yüksek enzim aktivitesi ultrafiltrasyon sonrasında 126.91 U/ml olarak tespit edilmiştir. Belirlenen optimum koşullar kullanılarak küçük ve büyük ölçekli (30-L) biyoreaktörlerde gerçekleştirilen enzim üretimlerine ait deneysel sonuçların 10 farklı matematiksel model ile uyumu incelenmiştir. Küçük ölçekli biyoreaktör denemeleri için deneysel veriler ile en uyumlu modeller Modifiye Gompertz, Modifiye Richards, Modifiye Lojistik ve Huang modelleri olarak tespit edilmiştir. Büyük ölçekli üretim için ise deneysel verilere en yakın aktivite tahminleri Modifiye Richards ve Modifiye Lojistik modelleri ile sağlanmıştır. Fermentasyonlardan elde edilen fermente sıvı örnekleri enzimin kısmi saflaştırması için 10 ve 100 kDa'lık ayırma sınırlarında ultrafiltrasyon kullanılmıştır. Ultrafiltrasyon öncesi ve sonrasına ait örneklerde protein miktar tayini yapılmış ve böylece spesifik aktivite değerleri belirlenmiştir. Ayırma sınırının 100 kDa olduğu ultrafiltrasyonda spesifik enzim aktivitesinde 2.45 kat artış sağlanmış ve 278.90 U/mg olarak belirlenmiştir. Ultrafiltrasyon sonrasında elde edilen permeat ve retentat örnekleri, enzimin toz formda ticari bir preparat olarak üretilebilme potansiyelini belirlemek amacıyla liyofilizasyon (dondurarak kurutma) işlemine tabi tutulmuş ve saflaştırma katsayıları tespit edilmiştir. Üretilen poligalakturonazın pektin, karboksimetil selüloz ve poligalakturonik asite olan ilgisi incelenmiş ve Km değerleri sırasıyla 21.2, 10.8 ve 4.1 mg/ml olarak bulunmuştur. Bununla birlikte, enzimin pektin, karboksimetil selüloz ve poligalakturonik asit substratlarında Vmax değerleri sırasıyla 101.7, 33.7 ve 40.2 µmol dk−1 mg−1 olarak belirlenmiştir. Üretilen poligalakturonaz Ag+, K+ ve Na+ iyonları ile etkileşime geçtiğinde aktivitesi stabil kalırken EDTA ajanı, Ba2+, Fe3+, Mn2+, Co2+ ve Sr2+ iyonlarının enzim üzerinde inhibitör etki gösterdiği tespit edilmiştir. Son olarak, fermentasyon öncesi, fermentasyon süreci ve fermentasyon sonrası aşamalarda kullanılmış olan hammadde, sarf ve enerji giderlerinin güncel birim fiyatları esas alınarak temel bir maliyet analizi hazırlanmıştır. Tez sonucunda; fermentör ortamında aşırı küf gelişimi ile kontrolü zorlaşan çalışma koşulları mikropartikül kullanımı ile iyileştirilerek standart-tekrar edilebilir üretimler gerçekleştirilmiş, üretim verilerinin matematiksel modellerle uyumlulukları belirlenmiş, üretilen poligalakturonaz başarılı bir şekilde karakterize edilmiş, kısmi olarak saflaştırılmış ve liyofilizasyon ile toz formda elde edilmiştir. Ayrıca doğal karbon kaynaklarının kullanımı için temel bir maliyet analizi yapılarak poligalakturonazın düşük maliyet ile üretim potansiyeli ortaya konmuştur.