Keçiboynuzu ekstraktının hyaluronik asit üretiminde karbon kaynağı olarak değerlendirilmesi ve üretim şartlarının optimizasyonu

Abstract

Hyaluronik asidin insan sağlığı açısından oldukça önemli bir biyopolimer olduğu ve hayvansal kaynaklardan izole edildiği ilk günden itibaren gerçekleştirilen çalışmalarla ortaya konmuştur. Düz zincirli doğal glukozaminoglikan polimeri olan bu polisakkarit doğal üretici olan Grup A ve Grup C Streptococcus türleri tarafından biyoteknolojik yöntemlerle de üretilebilmektedir. Sahip olduğu yüksek su tutma kapasitesi, viskoelastiklik, yüksek molekül ağırlıklarına ulaşabilme gibi özellikleri nedeniyle biyoyarayışlılığı yüksek olan bu biyopolimer ortopedik rahatsızlıkların tedavisinde, göz hastalıkları ve göz cerrahisinde, estetik cerrahisinde kullanılan dolgu materyallerinde, cilt yenilenmesi ve kırışıklık giderilmesinde, kanser hücrelerinin tespiti ve tedavisinde, ilaç taşıma sistemlerinde ve kozmetik sektöründe doğrudan veya yardımcı materyal şeklinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Oldukça yüksek kullanımı olan bu biyopolimerin fermentasyon şartlarının iyileştirilmesi ve üretim maliyetlerinin düşürülmesi biyoteknolojik yollarla gerçekleştirilen hyaluronik asit üretimi için büyük önem taşımaktadır. Bu tez çalışmasında, ülkemizde yüksek miktarda yetiştirilen keçiboynuzu meyvesinin karbon kaynağı olarak fermentasyon ortamında kullanılmasıyla yüksek katma değere sahip bir ürün olan hyaluronik asidin üretim potansiyeli araştırılmıştır. Tez çalışması kapsamında, öncelikle keçiboynuzu meyvesi ekstraktı kullanılarak Streptococcus equi subsp. zooepidemicus ATCC 39920 bakterisi ile hyaluronik asit üretim fermentasyonunun besiyeri içeriğinin optimizasyonu gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla kazein, maya ekstraktı, et ekstraktı ve pepton olmak üzere 4 farklı azot kaynağı ve MgSO4.7H2O, KH2PO4, NaCl, K2HPO4 ve FeSO4 gibi 5 farklı mineral kaynağı ile keçiboynuzu meyvesi ekstraktı besiyeri bileşenleri olarak belirlenmiştir. Besiyeri optimizasyonunu gerçekleştirmek üzere bu bileşenlere ek olarak inokülasyon oranını da içeren Plackett-Burman tasarımı oluşturulmuştur. Tasarımın sunduğu 15 farklı deneme için çalkalamalı inkübatörde 37°C sıcaklıkta, 150 rpm çalkalama hızında başlangıç pH 7.0 değerinde fermentasyonlar gerçekleştirilmiştir. Fermentasyonlar sonrasında tespit edilen hyaluronik asit miktarları yanıt yüzeyi olarak kullanılmış ve Plackett-Burman tasarımı ile besiyeri optimizasyonu gerçekleştirilmiştir. Optimum besiyeri ile çalkalamalı inkübatörde gerçekleştirilen fermentasyon sonunda hyaluronik asit miktarı 2.60 g/L olarak tespit edilmiştir. Varyans (ANOVA) analizi sonucunda; oluşturulan model, KH2PO4, NaCl ve FeSO4 istatistiksel olarak (P<0.05) olarak önemli bulunmuştur. Bu doğrultuda elde edilen optimum besiyeri bileşimi kullanılarak biyoreaktörde hyaluronik asit üretimleri gerçekleştirilmiştir. Fermentasyon parametrelerinin üretilen hyaluronik asidin molekül ağırlığı üzerine etkisi Box-Behnken cevap yüzey tasarımı kullanılarak incelenmiştir. Havalandırma miktarı, karıştırma hızı ve başlangıç biyokütle yoğunluğu olarak seçilen bağımsız değişkenler ile deneme deseni oluşturulmuş ve fermentasyonlar gerçekleştirilmiştir. Ayrıca preperatif HPLC kullanılarak moleküler ayırma (size exclusion, SEC) kromatografisi ile hyaluronik asitin moleküler ağırlık aralıkları belirlenmiştir. Biyoreaktör denemeleri sonucunda oluşturulan model ve havalandırma miktarı istatistiksel olarak önemli bulunmuştur (P<0.05). Tez çalışması sonucunda alternatif bir karbon kaynağı olan keçiboynuzu meyvesinden optimum besiyerinde çalkalamalı inkübatörde 2.60 g/L hyaluronik asit üretilmiştir. Bununla birlikte biyoreaktörde üretilen hyaluronik asidin ortalama molekül ağırlığının 500 kDa ile 1750 kDa arasında değiştiği tespit edilmiştir. Böylece keçiboynuzu meyvesinin katma değeri yüksek bir ürün olan hyaluronik asit üretiminde kullanılabileceği kanıtlanmış, bu hammaddeyi içeren besiyerinin optimum bileşimi ve fermentasyon şartları tespit edilmiştir.