Chlamydomonas reinhardtii'de SEC24B insersiyonel mutantlarının genetik bağlantı ve fenotipik analizleri

Abstract

COPII, endoplazmik retikulumun (ER) membranında oluşan küçük membran veziküllerinin oluşturulmasından sorumlu olan yüksek oranda korunmuş bir protein grubudur. Bu protein grubunun bileşenlerinden biri olan SEC24 proteini COPII vezikül oluşumunda yer alan, ER membranında bulunan taşınacak kargo proteinine bağlanmadan sorumlu birincil alt bileşen olarak kabul edilmektedir. Chlamydomonas reinhardtii (C. reinhardtii) genomunda COPII vezikül oluşumunda rol alması olasılığı olan iki SEC24 gen modeli (SEC24A- SEC24B) mevcuttur. Bu tez çalışmasında henüz literatürde çalışılmamış bir konu olan C. reinhardtii'de SEC24B genin mutasyon analizi yapılarak, bu genin fonksiyonunun belirlenmesi amaçlanmıştır. C. reinhardtii'nin sec24b mutant suşu bu çalışmada kullanılmıştır. İnsersiyon bölgesinin varlığını belirlemek için sec24b mutant suşu klonlarından genomik DNA izole edilmiş ve insersiyonun bulunduğu bölge PZR ile çoğaltılmıştır. Genetik bağlantının belirlenmesi için mutant suş yabanıl tiple çaprazlanmış ve projenide paromomisin dayanıklılık fenotipi testi yapılmıştır. SEC24B mRNA'sının bulunup bulunmadığı RT-PZR yapılarak belirlenmiştir. sec24b mutant suşu klonlarında sekresyon işlevinin olup olmadığını belirlemek için arilsülfataz ve alkalen fosfataz aktivitelerinin kolorimetrik olarak testi yapılmıştır. Bu çalışmalar sonucunda sec24b mutant suşunun genomunda tek bir insersiyon varlığı tespit edilmiştir ve projeninin %50'si paromomisine dayanıklıdır. Paromomisine dayanıklı projenilerde gendeki insersiyonun varlığı tespit edilmiştir. SEC24B proteininde mutasyon olan projenilerde ER'dan Golgi'ye protein transferinde problem olduğundan projenide normal hücrelere oranla daha yavaş büyüyen hücrelerin olduğu görülmüştür. Yapılan bu tez çalışması ile elde edilen veriler C. reinhardtii' nin SEC24B genin fonksiyonu üzerine literatüre bilgi kaynağı sağlandığı düşünülmektedir.