İnülinaz enziminin üretimi, kısmi saflaştırılması, karakterizasyonu ve fermentasyonlarının matematiksel modellenmesi üzerine bir araştırma

Abstract

Bu çalışmanın amacı, enzim üretimi için en iyi karbon kaynağını belirlemek, enzim üretiminde kullanılan besiyeri formülasyonunu otimize etmek, üretilen enzimi kısmi saflaştırmak, enzimin özelliklerini belirlemek ve fermentasyonları ve substrat spesifikliğini matematiksel modellemektir. Elde edilen sonuçlara göre, Aspergillus niger A42 (ATCC 204447) ile inülinaz (Iase) enziminin üretiminde kullanılan on farklı karbon kaynağı arasından en iyisi melas olmuştur (383.73 U/mL). Üretilen enzimin optimum çalışma koşulları pH 4.8, 60ºC sıcaklık ve 10 dk inkübasyon süresi olarak belirlenmiştir. Plackett-Burman Dizayn (PBD) ile besiyeri kompozisyonunun optimizasyonunda, optimum besiyeri %1 maya ekstraktı ve %1 peptondan oluşmuştur (Iase=1011.02 U/mL, sukraz (Sase)=834.28 U/mL ve I/S oranı=1.22). Besiyerinde kullanılan maya ekstraktı ve peptonun konsantrasyonu, Merkezi Kompozit Dizayn (MKD) ile optimize edilmiş ve optimum besiyeri kompozisyonu %4.2 maya ekstraktından oluşmuştur (Iase=1294.50 U/mL, Sase=1076.85 U/mL, I/S oranı=1.20). Kinetik modelleme neticesinde, PBD ile optimize edilen besiyerinde enzim üretimi fungal gelişimden bağımsızdır (α≤0 ve β≠0). MKD ile optimize edilen besiyerinde ise enzim üretimi karışık gelişimle ilgilidir (a≠0 and β≠0). Küçük ölçekli biyoreakördeki (5-L) fermentasyonlar, pH kontrolsüz ve havalandırmalı ortamda gerçekleştirilmelidir (Iase=1810.76 U/mL, Sase=1537.88 U/mL ve I/S oranı=1.18). Büyük ölçekli biyoreaktörde (30-L) gerçekleştirilen fermentasyonun sonucunda Iase, Sase ve I/S oranı sırasıyla 791.35 U/mL, 616.90 U/mL ve 1.28 olarak belirlenmiştir. Elde edilen enzim solüsyonu, santrifüj-süre kombinasyonu (16873 g-5 dakika, Iase=1181.18 U/mL, saflaştırma katsayısı (SK)=1.39) ve UF membranı (10 kDa, Iase=12065.20 U/mL, SK=5.33) ile kısmi olarak saflaştırılmıştır. Diğer yandan, enzimin substrat spesifikliğinde, aktivitesi düşük olan enzimin inüline olan afinitesinin sukrozdan daha yüksek olduğu belirlenmiştir (Km inülin=17.79 g/L < Km sukroz=49.43 g/L). Tam tersine, aktivitesi yüksek olan enzimin sukroza olan ilgisinin inülinden daha yüksek olduğu tespit edilmiştir (Km inülin=28.77 g/L > Km sukroz=25.95 g/L). Substrat üzerine eklenen enzim miktarının artması ile birlikte aktivitenin arttığı belirlenmiştir. Mn2+, enzimin aktivatörü, Cu2+ ve Ag+ ise enzimin inhibitörü olmuştur. Üretilen enzimin 30ºC, 40ºC ve 50ºC sıcaklıklarda termostabil olduğu belirlenmiştir. Ek olarak, enzimatik reaksiyonun termal inaktivasyon ve termodinamik parametreleri de hesaplanmıştır. Buna göre Ea, Eia ve Z değerleri sırasıyla 37.3 kJ/mol.K, 112.86 kJ/mol ve 12.80ºC olarak hesaplanmıştır. Sıcaklık 60ºC'den 80ºC'ye artırıldığında, enzimin inaktivasyon hız sabiti ve entropisi artarken yarılanma ömrü, D-değeri, entalpi ve serbest enerjisi azalmıştır. Bunun yanısıra, enzimin moleküler ağırlığının 60-70 kDa arasında olduğu belirlenmiştir. PBD ve MKD ile optimize edilen besiyeri kompozisyonunda gerçekleştirilen fermentasyonların deneysel verileri matematiksel modeller kullanılarak tahmin edilmiştir. Öte yandan, deneysel kinetik parametre değerleri de modellerden tahmin edilen değerler kullanılarak hesaplanmış ve karşılaştırılmıştır. Son olarak, enzimin substrat spesifikliğinin deneysel verileri de matematiksel modeller kullanılarak tahmin edilmiştir. Deneysel Vmax ve Km değerleri, modellerden tahmin edilen Vmax ve Km değerleri ile karşılaştırılmıştır. En iyi model(ler), model kıyaslama verilerine (ortalama karesel hata (RMSE), ortalama mutlak hata (MAE), ortalama standart sapma (MSD), belirleme katsayısı (R2), eğim (m), Akaike bilgi ölçütü (AIC), ön yargı faktörü (BF) ve kesinlik faktörüne (AF)) göre tespit edilmiştir. Sonuç olarak, inülinaz enziminin üretimi, fermentasyonların kinetik modellemesi, üretilen enzimin kısmi saflaştırılması ve karakterizasyonu ve fermentasyonlar ve substrat spesifikliğinin modellenmesi başarılı bir şekilde gerçekleştirilmiştir. Çalışma, hem fermentasyon öncesi (upstream processing) hem de fermentasyon sonrası (downstream processing) prosesleri içermektedir.