3. Jenerasyon HIV tabanlı lentiviral vektörlerin in vivo uygulamalar için üretimi ve pürifikasyon yöntemlerinin optimizasyonu

Abstract

Amaç: Lentiviral vektörler (LVV); güvenlik, etkinlik ve uzun süreli ekspresyon açısından tercih edilen, klinik gen tedavi denemelerinde kullanımı her geçen gün artan gen nakil araçlarıdır. Bu vektörlerin terapötik etkinlikleri, üzerlerinde taşıdıkları genlere bağlı olsa da, in vivo uygulamalarda kullanılmaları için, yüksek kalite ve saflıkta üretilmeleri gerekmektedir. Dolayısıyla hem deneysel hem klinik çalışmalarda kullanılabilirliğini arttırabilmek için yeni üretim ve saflaştırma metotları geliştirilmelidir. Yapılan çalışmada, in vivo gen nakil uygulamalarında kullanılmak üzere, uygun titre ve kalitede; yüksek saflıkta, biyogüvenilir lentivirus eldesi için, vektör konsantrasyon ve pürifikasyon tekniklerinin geliştirilmesi hedeflenmiştir. Yöntem: Döner hücre kültürü şişelerindeki 293T hücrelerinin, paketleme ve transfer plazmidleriyle, Chloroquine varlığında geçici CaPO4 transfeksiyonu sonucu 3. nesil LVV üretildi. Ardından düşük hızda santrifügasyon ve filtrasyon ile hücresel debris giderimi yapılıp, sükroz yataklı, yüksek hızlı ultrasantrifüj işlemi ile virus konsantrasyonu gerçekleştirildi. Konsantre edilen viral örnekler; hücresel nükleik asit yıkımı için benzonaz ile muamele edildikten sonra, iyon değişim kromatografisi ile saflaştırma işlemine tabi tutuldu. Elde edilen vektörlerin genoma entegre kopya sayıları kantitatif Real-Time PCR ile hesaplanırken, protein giderim oranları SDS-PAGE ile belirlendi ve MTT testi ile bu vektörlerin hücre canlılığına etkisi değerlendirildi. Bulgular: Yapılan optimizasyon işlemleri ardından %10 FBS ve 25 uM Chloroquine içeren IMDM besiyerindeki transfeksiyonu takiben %10 FBS içeren OPTIMEM besiyerinde yapılan viral üretim metoduyla transdüksiyon etkin LVV'ler başarıyla elde edildi. Viral titre, fonksiyon ve saflık analizleri doğrultusunda, ultrasantrifüj ile 200 kat konsantre edilen örneklerin kromatografik pürifikasyonu ile safsızlıklarından %90 oranında arındırıldığı belirlenirken, viral titre 6,2x10^10 TU/mL olarak hesaplandı. LVV üretiminin başlangıcından son ürüne dek yapılan tüm alt akım işlemlerinin ardından HIV p24 ELISA testi ile toplam vektör geri kazanımı %53 olarak belirlendi. Sonuç: Gerçekleştirdiğimiz bu çalışma ile, genel laboratuvar koşullarına uyarlanabilir özellikte ve oldukça pratik, optimize ve ölçeklendirilebilir bir üretim ve saflaştırma metodu geliştirilmiştir.