Kasava (Manihot esculenta C.) bakteriyel yanıklık hastalık etmeni Xanthomonas axonopodis pv. manihotis’in real-time PCR ile tanısı, tespiti ve pulsed-field jel elektroforezis ile moleküler karakterizasyonunun yapılması

Abstract

Kasava (Manihot escualanta Crantz) Gana' da önemli bir kültür bitkisidir. Bu çalışmada, Gana'nın 8 farklı bölgesinden toplanan, Kasava Yanıklık Hastalığı simptomları gösteren örnekler izole edilmiş ve besi ortamında- Nütrient Agar (NA, Acumedia, USA) ve X. axonopodis pv. manihotis (Xam) yarı seçici ortam, Cefazolin Trehalose Agar (CTA) üzerinde geliştirilmiştir. İzolatların duyarlı kasava Esam çeşidindeki patojenisite test sonucunda, izolatların (toplam 32 adet) hepsi Xam simptomları göstermiş ve inoküle edilen kasava bitkilerinden izole edilerek Koch postulatları tamamlanmıştır. Klasik PCR' da, Xanthomonas spesifik primer, RST2/RST3 ve Xam spesifik Değişken Numara Tandem Tekrarlama (VNTRs) lokus primeri, XaG1_67F/R, farklı bitki patojeni bakterilerin genomlarından hiçbir amplifikasyon tespit edilmemesine rağmen, test edilen tüm Gana ve referans Xam strainlerinden 840 ve 446 ba'lik amplifikasyonlar elde edilmiştir. Ortaya çıkan PCR ürünleri, GenBank nükleotit veri tabanından alınan Xam strainleri ile %93 ile %100 arasında homoloji gösterdiği BLASTn programı kullanılarak ortaya çıkarılmıştır. Kasava yetiştiriciliğinde önemli ürün kayıplarına sebep olan Kasava Bakteriyel Yanıklık etmeni Xam' in Real-Time PCR yöntemi ile kısa sürede, hassas bir şekilde tanısını yapmak amacıyla primer ve prob (LNA, Locked Nucleic Acid) setleri geliştirilmiştir. Geliştirilen primer ve prob setlerinin spesifikliği; farklı Xam strainleri, farklı bitki patojeni bakteriler ve kasava genomik DNA'sı kullanılarak test edilmiştir. Xam izolatların LNA probu kullanılarak Real-Time PCR yöntemi ile hassas ve seçici olarak tanıları ve tespitleri yapılmıştır. PCR analiz sonuçlarına göre, Kasava Bakteriyel Yanıklığı Hastalığın Ganadaki yaygınlığı en yüsek Ashanti (%70) bölgesinde olup, Volta (%60), Brong-Ahafo (%40), Eastern (%40) ve Greater Accra (%20) şekilde sıralamıştır. Bu çalışmada geliştirilen yöntemin bakteriyel hücre hassasiyet sınırı X. a. pv. manihotis 1 hücre olarak tespit edilmiştir. Geliştirilen yöntemin DNA düzeyindeki hassasiyet sınırı ise, 13 pg olarak tespit edilmiştir. Sonuç olarak, Real-Time PCR yöntemini kullanarak her birine özel primer ve prob setleri geliştirilen Kasava Bakteriyel Yanıklık Hastalığına sebep olan X. a pv. manihotis'nin hem bakteriyel hücreden hem de hastalıklı bitki dokularından hızlı (20-25 dk) ve hassas bir düzeyde tanı ve tespitlerinin yapılabileceği ortaya çıkarılmıştır. Pulsed-Field Jel Elektroforezis (PFGE) yöntemi ile Gana'da yaygın kasava üretimi yapılan beş farklı bölgeden izole edilen Xam izolatları arasındaki genotipik farklılıkları az sıklıkla kesen restriksiyon enzimleri kullanılarak ortaya çıkarılmıştır. Gana'dan toplanan 32 izolat arasındaki genetik farklılıklar PFGE tarafından SpeI enzimi kullanılarak belirlenmiştir. PFGE sonuçlarına göre tüm izolatların iki farklı haplotip oluşturmuştur.