Mannanaz üretimi ve saflaştırılmasında yeni teknik ve stratejilerin denenmesi üzerine bir araştırma

Abstract

Galaktomannanlardaki β-1,4 mannoz bağlarını parçalayan β-mannanaz enziminin ana üreticisi farklı Aspergillus türlerinden oluşan filamentli fungus grubunun üyeleridir. Enzim rahatlıkla katı kültür besiyerinde veya erlenmayerlerde üretilebilmektedir. Ancak bu tekniklerle üretim sınırlı kalmaktadır. Üstelik mikroorganizma katma değeri yüksek bu ürünleri üretirken havalandırmaya da ihtiyaç duymaktadır. Bu nedenle de biyoreaktörlerin Aspergillus fermentasyonlarında kullanılması gerekmektedir. Ancak küflerin aşırı hif gelişimine bağlı olarak biyoreaktörlerde kontrolü oldukça zordur. Bu çalışmada, magnezyum silikat ve alüminyum oksit mikropartikülleri kullanılarak rekombinant Aspergillus sojae'nin hücre gelişiminin keçiboynuzu ekstraktı besiyerinde kontrolünün sağlanması ve β-mannanaz enzimi üretiminin arttırılması amaçlanmıştır. Her iki mikropartikül de erlenmayer ve biyoreaktör fermentasyonlarında hücre gelişimini arttırmış ve kontrolünü sağlamıştır. Ayrıca β-mannanaz enziminin fermentasyon sıvısından kısmi saflaştırılması, liyofilizasyonu ve enzim karakterizasyonu (enzimin çalışma şartları, farklı substratlar varlığında Km ve Vmax değerleri, iyon inhibisyonu vs) da gerçekleştirilmiştir. Öncelikle farklı oranlarda alüminyum oksit ve magnezyum silikat içeren besiyerleri ile çalkalamalı inkübatör denemeleri gerçekleştirilmiştir. En yüksek β-mannanaz aktivitesi değeri 568,72 U/ml olarak 5 g/L magnezyum silikat ilave edilen erlenmayer denemesinde elde edilmiştir. Besiyerine ilave edilen mikropartikül konsantrasyonu arttıkça hücre pellet çapı değerleri düşmüştür. Ayrıca 10 g/L'den daha fazla magnezyum silikat ilavesi durumunda hücre gelişimi pellet yapı yerine pellet/miselyum karışık tipte gerçekleşmiştir. Biyoreaktör denemelerinde ise en yüksek β-mannanaz aktivitesi değeri 643,16 U/ml olarak 3 g/L magnezyum silikat ilave edilen besiyerinde hesaplanmıştır. Mikropartikülle gerçekleştirilen tüm biyoreaktör denemeleri ise kontrol fermentasyonundan daha yüksek sonuçlar vermiştir. Ayrıca kontrol fermentasyonu hariç tüm mikropartiküllü biyoreaktör denemelerinde fermentasyon sonlandırılıncaya kadar hif gelişimi kolaylıkla kontrol edilmiştir. Biyoreaktörde gerçekleştirilen denemelerde hiçbir mikropartikül konsantrasyonunda hücre gelişim tipi pellet yapıdan pellet/miselyum karışık tipine dönüşmemiştir. Kısmi saflaştırma işlemi ise ultrafiltrasyon ile gerçekleştirilmiş ve enzim solüsyonu başarıyla liyofilize edilmiştir. Enzim karakterizasyonu da başarıyla gerçekleştirilmiş ve optimum çalışma pH ve sıcaklık aralığı sırasıyla pH 5-6 ve 50-60°C olarak belirlenmiştir. Keçiboynuzu gamı da β-mannanaz enzimi için en iyi substrat olarak belirlenmiştir. Keçiboynuzu gamının substrat olarak kullanıldığı denemede Vmax ve Km değerleri sırasıyla 2719 U/mg ve 2,26 µmol/ml olarak hesaplanmıştır. Son olarak farklı reaktiflerin enzim çalışmasına etkisi belirlenmiştir. Bu çalışma sonucunda β-mannanaz enzimi üretiminde karıştırmalı tip tank biyoreaktör, kısmi saflaştırma işlemlerinde ise ultrafiltrasyon sisteminin kullanılabileceği açıkça gösterilmiştir. Dolayısıyla sonuçlar rekombinant Aspergillus sojae ile biyoreaktörde β-mannanaz enziminin üretiminde farklı mikropartikül ajanlarını içeren keçiboynuzu ekstraktının substrat olarak kullanılabileceğini göstermiştir. Bu tekniğin diğer filamentli küflerin büyük ölçekli biyoreaktör sistemlerinde gerçekleştirilecek fermentasyonlarda da kullanılabileceği ve katma değeri yüksek enzimlerin üretilebileceği düşünülmektedir.