Sünme etmeni Bacillus türü bakterilerin hücre dışı peptidaz üretme yeteneklerinin belirlenmesi, peptidaz üretiminin kısmi optimizasyonu, saflaştırılması ve karaterizasyonu

Abstract

Bu çalışmada; Bacillus türlerinin peptidaz üretme kapasitelerinin ve bu peptidazların endüstriyel kullanım için uygun olup olmadıklarının değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla, üretilen peptidazların kısmi optimizasyonu, saflaştırılması ve karakterizasyonu yapılmıştır. Çalışmanın ilk aşamasında sünmüş ekmekten izole edilmiş 39 adet Bacillus türü hemolitik (Hbl) ve hemolitik olmayan (Nhe) enterotoksin üretimi açısından toksin kitleri yardımıyla taranmıştır. Ardından bu toksinlerin her ikisini de üretmediği tespit edilen 14 adet suşun 30 °C, 37 °C, 50 °C ve 55 °C'de hücre dışı peptidaz üretme yetenekleri, peptidaz aktivitesinin ölçülmesi suretiyle belirlenmiştir. Peptidaz üretiminde kullanmak üzere bu 14 suştan ünite/ml cinsinden peptidaz aktivitesi en yüksek olan K1 ve K10 suşları ile ünite/ml/OD cinsinden aktivitesi en yüksek olan N8 suşu seçilmiştir. Karşılaştırma sağlayabilmek için Bacillus subtilis PY22, B. subtilis RSK 244 ve B. subtilis RSK 246 suşlarının da peptidaz aktivitesi belirlenmiştir. Çalışmanın ikinci aşamasında; bir kerede bir faktör yaklaşımı kullanılarak seçilen K1, K10 ve N8 suşları için en uygun enzim üretim besiyeri bileşimi ve koşulları belirlenmiştir. Bu amaçla en iyi aktivite değerini sağlayan karbon ve azot kaynağı ile karbon/azot oranı, çalkalama hızı ve ön kültür besiyeri maliyet unsuru da göz önünde bulundurularak tespit edilmiştir. En iyi karbon ve azot kaynağının sırasıyla, glukoz ve maya ekstraktı olduğu saptanmıştır. Ayrıca karbon/azot oranının 1:5, çalkalama hızının 250 rpm olması durumunda ve ön kültür hazırlanması için enzim üretim ortamı ile aynı besiyeri kullanıldığında daha iyi aktivite değeri elde edilmiştir. Çalışmanın üçüncü aşamasında; bir önceki aşamada en iyi peptidaz aktivitesi sağlayan K1 suşu kullanılarak yanıt yüzey yöntemi ile peptidaz üretiminin optimizasyonu çalışması yapılmış; sıcaklık, besiyeri başlangıç pH'sı ve inokülasyon oranı faktör olarak seçilmiştir. Peptidaz üretimi açısından K1 suşu için en uygun sıcaklık 33.4 °C, besiyeri başlangıç pH'sı 6.62, inokülasyon oranı %2.3 olarak belirlenmiştir. Bu koşullarda peptidaz aktivitesi 49.17 ünite/ml olarak ölçülmüş, spesifik aktivite ise 504.77 ünite/mg olarak hesaplanmıştır. Son aşamada ise optimum koşullarda üretilen ham enzim çözeltisi (peptidazlar), afinite kromatografisi kullanılarak saflaştırılıp bazı özellikler açısından karakterize edilmiştir. Peptidazlar %25 verim ve 1.53 katlık saflaştırma katsayısı ile kısmi olarak saflaştırılabilmiştir. Kısmi saflaştırılan peptidaz çözeltisinin optimum pH'sının 7.5 olduğu ve pH 7.0-8.5 arasında 37 °C'de 2 saat inkübasyon sonunda aktivitesini yaklaşık %90 oranında koruduğu tespit edilmiştir. Kısmen saflaştırılan peptidaz çözeltisinin optimum sıcaklığının 60 °C olduğu ancak 50 °C'de aktivitesini 60 °C'ye göre daha uzun süre koruduğu belirlenmiştir. Kısmi olarak saflaştırılan enzim çözeltisinin O-FEN ve EDTA (1-4 mM) varlığında inaktive olması, baskın peptidazın metalopeptidaz olduğunu göstermiştir. Ayrıca SDS-PAGE ve zimografi analizlerinin karşılaştırmalı olarak değerlendirilmesi ile kısmen saflaştırılan enzim çözeltisindeki metalopeptidazın molekül ağırlığının 36 kDa civarında olduğu tespit edilmiştir. Enzim aktivitesini 5 mM K+1 %4, 5 mM Mn+2 iyonu da %6 oranında artırırken; Hg+2 ve Fe+3 iyonları, enzimi inaktive etmiştir. Kısmi saflaştırılan enzim çözeltisinin SDS (%0.1-1.0 w/v) varlığında inaktive olduğu; %0.1-1.0 (v/v) Triton X-100, Tween 20, Tween 80 ile %1-20 (v/v) ksilen, etanol, aseton ve asetonitril varlığında ise bu maddelerin konsantrasyonuna da bağlı olmak üzere 37 °C'de 30 dakika inkübasyon sonunda aktivitesini büyük ölçüde koruduğu belirlenmiştir.