Chlamydomonas reinhardtii arilsülfataz genlerinin ekspresyon düzeylerinin semi-kantitatif PCR ve qPCR yöntemleri ile belirlenmesi

Abstract

Arilsülfatazlar, sülfatı diğer moleküllerden hidrolize eden enzimlerdir. Bu enzimler mikroorganizmalar ve hayvanlarda bulunmaktadır, fakat literatürde bitkilerde arilsülfataz enziminin bulunmadığı ve bitkilerde sülfataz aktivitesinin olmadığı savunulmaktadır. İnsanda arilsülfataz genlerindeki mutasyonlar farklı hastalıklara sebep olmaktadır. Bu veriler arilsülfatazların biyoteknoloji, tıp ve ziraat alanlarında önemli enzimler olduğunu göstermektedir. Çalışmada model organizma Chlamydomonas reinhardtii genomunda bulunan 19 adet arilsülfataz (ARS) geni Phytozome veri tabanında belirlenmiş, gen ve protein sekansları alınmıştır. Literatürde bunlardan ARS1 ve ARS2 genleri üzerine yapılmış çalışmalar bulunmaktadır; bu tez çalışması diğer 17 gen modeli üzerine yapılan ilk fonksiyonel çalışmadır. Biyoinformatik araçlarla olası protein sekanslarının domain, motif ve moleküler filogeni analizleri yapılmıştır. Biyoinformatik çalışmalar gen modellerinin arilsülfataz proteinleri olduğunu desteklemiştir. Bu genlerin sülfat eksikliğinde transkripsiyon seviyelerinde değişiklik olup olmadığını belirlemek için RT-PCR analizleri yapılmıştır. RT-PCR analizleri için C. reinhardtii hücreleri, ilk olarak normal besi yerinde (TAP) çoğaltılıp ardından sülfatsız besi yerine (TAP -S) geçirilmiş ve belirli zaman aralıklarında kültürlerden örnekler alınmıştır. Alınan örneklerden RNA izolasyonu yapılmış, ardından RNA'lar cDNA'ya çevrilmiş ve cDNA'lar ile PCR reaksiyonları kurulmuştur. Sonuçlar, 17 ARS geninden ARS6, ARS7, ARS11, ARS12, ARS13, ARS17 ve ARS19'da sülfatsız ortamda transkripsiyonda artış olduğunu göstermiştir; fakat bu artış pozitif kontrol genindeki (ARS2) artış kadar yüksek değildir. İlginç olarak, diğer genlerdeki artış 5. saat sülfat açlığında görülürken, ARS17 genindeki artış 24. saatte görülmüştür. C. reinhardtii ve diğer organizmalardaki ARS protein dizileri kullanılarak filogenetik ağaç çizilmiştir. Ağaçta C. reinhardtii proteinlerinin, Volvox carteri proteinleri ile yakın dallarda olduğu; Homo sapiens ve bakteri türleri ile ayrı grupta kümelendiği görülmüştür. Sonuç olarak C. reinhardtii genomunda 19 ARS geni bulunduğu saptanmıştır. Bu sonuçlar ilerideki uygulamalara ışık tutacaktır.