Hıyarda (Cucumis sativus L.) elongation factor eIF(iso) 4E geninin transformasyonu ve bitki rejenerasyonu

Abstract

Hıyar (Cucumis sativus L.) domatesten sonra ülkemizde en çok üretimi yapılan sebzelerden biridir. Ancak biyotik ve abiyotik stresler hıyarın yaşam döngüsünü olumsuz yönde etkileyerek verim ve kalitenin düşmesine neden olmaktadır. Viral bitki patojenlerinin ökaryotik çeviri başlatma faktörlerinden biri olan eIF (iso) 4E ile etkileşim mekanizmaları C. sativus dahil bazı türlerde yapılan çalışmalar ile aydınlatılmıştır. Ancak elde edilen transgenik bitkilerin rejenerasyon frekansları düşüktür. Yüksek transformasyon verimi bitki rejenerasyon kapasitesi ile yakından ilgili olmakla beraber, çalışılacak farklı genotiplerde etkili bir transformasyon verimi için hem bitki rejenerasyonu hem de transformasyon için optimizasyonlar gereklidir. Bu çalışmada, CRISPR/Cas9 gen düzenleme teknolojisi kullanarak iki hıyar genotipinde (G27 ve G247) eIF (iso) 4E'nin susturulması planlanmıştır. Bunun için öncelikle transformasyon öncesi genotiplerde bitki rejenerasyon optimizasyonu yapılarak, adventif sürgün organogenesisi için en uygun eksplant (3 eksplant arasından) ve kültür ortamı (kontrol dahil 50 ortam arasından) içeriği tespit edilmiştir. Daha sonra transformasyonu etkileyebilecek önemli faktörler (genotip, bakteri ırkı, fide yaşı, eksplant tipi, pre-inkübasyon, antibiyotik tipi ve markası) optimize edilmeye çalışılarak, tasarlanan rehber RNA (sgRNA1 ve sgRNA2)'lar ve Cas9 Agrobacterium tumefaciens aracılığı ile her iki genotipin eksplantlarına aktarılmıştır. Hem bitki rejenerasyonu hem de transformasyon için yapılan optimizasyon çalışmalarının ardından, eşit koşullarda gerçekleştirilen 8 transformasyonda elde edilen sürgün sayısı / 100 eksplant ortalaması G27 ve G247 için sırasıyla 13.6 ve 18 olarak tespit edilmiştir. Elde edilen ex vitro aday transgenik bitkilerden (T0) rastgele seçilen bazı hıyar hatları, aktarılan genleri taşımaları bakımından PCR analizi ile test edilmiştir. TAGEM/18 /AR-GE/03 nolu proje kapsamında yürütülen bu çalışmada, test sonucu pozitif çıkan bitkilerde sera koşullarında devam eden yetiştiricilik ve melezleme çalışmaları ile elde edilecek olan T1 bitkilerinde daha sonra sekans analizleri yapılacaktır.