Engineering, production, and characterization of glycosylated and in vivo deglycosylated forms of anti-PA83 in Nicotiana Benthamiana

Abstract

B. anthracis potansiyel bir ajan olarak kullanıldığından, güvenli, düşük maliyetli, yüksek etkili ve uzun süreli stabiliteye sahip bir şarbon aşısı geliştirebilmek çok önemlidir. Son yıllarda yapılan çalışmalar, bitki bazlı geçici ekspresyon sistemlerinin, yüksek ekspresyon kapasiteleri nedeniyle rekombinant proteinlerin güvenli, hızlı ve ucuz bir şekilde üretilmesini sağlayan umut verici bir teknoloji olduğunu göstermektedir. Monoklonal antikorlarla tedavi hastalığın etkilerini ve patojenin yayılmasını azaltmak için kullanılan kanıtlanmış bir yaklaşımdır. Tam uzunluktaki antikorların çoğu, rekombinant antikor üretme potansiyeline sahip olan memeli hücre kültürü, bakteri, maya, böcekler ve bitki ekspresyon sistemlerinde üretilir. Bitki ekspresyon sistemleri, patojenlere karşı pasif koruma sağlayabilen rekombinant terapötik mAb'ler üretmek için en etkili sistemlerden biridir. Bitki ekspresyon sistemleri, büyük ölçekli üretim, maliyet verimliliği, ölçeklenebilirlik ve güvenlik açısından faydalıdır. Şarbona karşı toksini nötralize etme kapasitesine sahip bitki monoklonal anti-PA83 antikoru, şarbona karşı güvenli, etkili ve düşük maliyetli aşı adayları geliştirmek önemlidir. Son çalışmalarda; bitki ekspresyon sistemi kullanılarak üretilen ve şarbon koruyucu antijene karşı etkili olan anti-PA83 monoklonal antikoru, mutasyon (Mett vd. 2011) ile glikosile ve deglikosile edilen bitkilerde üretildi. Bu tezde, anti-PA83 proteininin deglikosilasyonu için in vivo PNGase F (Mamedov vd. 2012) ve Endo H (Mamedov vd. 2017) deglikosilasyon stratejisi kullanılmıştır. Bu çalışmada, tam uzunlukta anti-PA83 proteinlerinin glikosile ve deglikosile formları, önceki çalışmalarda kodon optimize edilmiş ve Agrobacterium hücrelerine aktarılan HC ve LC genlerinin birlikte ekspres edilmesiyle üretilmiştir. Bu tez çalışmasında üretilen proteinler, amonyum sülfat ile çöktürülüp protein A kolon kromatografisi yardımıyla saflaştırılarak, antikor-antijen etkileşimini, protein stabilitesini ve antikorların toksin nötralize edebilme yeteneğini incelemek amacıyla kullanıldı. Tez sonuçlarına göre, Endo H ile deglikozile edilmiş anti-PA83, diğer anti-PA83 varyantlarından daha fazla stabilite ve aktivite göstermiş olup ve bu durum Endo H ile deglikozile edilmiş anti-PA83'nin iyi bir aşı adayı olarak kullanılabileceğini gösterir.