Pichia pastoris mayasında alkol dehidrogenaz (ADH3) promotoru ile rekombinant fitaz enzimi üretimi

Abstract

Fitaz enzimi kağıt endüstrisinde, gıda sanayide, myo-inositol fosfatların hazırlanmasında ve özellikle yem sanayide kullanılan önemli bir enzimdir. Fitazlar genellikle hayvan beslenmesinde kullanılır. Fitazlar, fitattan fosfatı ayırarak fosforun yeme takviye ihtiyacını azaltır, yemin besleyici değerini arttırır ve atılan fosfor seviyesini düşürürür. Böylece biyoyararlılık artar ve çevresel kontaminasyon azalır. Gıda ve yem endüstrisinde kullanılan fitazlar genellikle bakteriler ve funguslardan elde edilmektedir. Mikrobiyal fitazlar geniş pH aralıklarında termostabil olarak bilinir. Son zamanlarda doğal kaynaklı enzimlerin yetersiz olmasından dolayı rekombinant üretimlerine olan ilgi artmıştır. Pichia pastoris rekombinant protein üretiminde sıklıkla kullanılan bir mayadır. Metanol, glikoz, sorbitol, gliserol, mannitol gibi karbon kaynaklarının yanı sıra etanolü de karbon kaynağı olarak kullanabilmektedir. Bu çalışmada Escherichia coli fitaz geni metilotrofik bir maya olan P. pastoris'te alkol dehidrogenaz (ADH3) promotoru kontrolü altında üretilmiştir. Sentetik SNT5 ve doğal ADH3 promotoru (900 bç) kullanılarak rekombinant fitaz üretilmiş ve iki promotor ile üretilen fitaz verimleri karşılaştırılmıştır. Elde edilen üretim suşlarının kopya numaraları Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (GT-PZR) analizi ile belirlenerek tek kopya klonlar seçilmiş ve erlenmayerde 96 saat boyunca etanol ile beslenerek üretimi gerçekleştirilmiştir. Sentetik ADH3 promotoru ve doğal ADH3 promotoru için enzim aktiviteleri sırasıyla 12203 U/ml ve 7613 U/ml olarak hesaplanmıştır. Sentetik promotorun doğal promotora göre 96. saat sonunda yaklaşık % 60 daha fazla aktivite gösterdiği belirlenmiştir. SDS-PAGE analizi sonucu fitazın moleküler ağırlığının yaklaşık 55 kDa olduğu saptanmıştır. Enzimin optimum çalışma şartları pH 4.0 ve 60°C olarak tespit edilmiştir. Enzim 2 saatte pH 2.5-6.0 arası %90'ın üzerinde stabilitesini korumuştur. Fitaz 30 dakikada 60°C ve 75°C'de sırasıyla %87 ve %49 aktivitesini korumuştur. Fitaz aktivitesi Ca+2 ve Mg+2 iyonları tarafından artırılırken Cu+2, Zn+2 ve Fe+2 iyonları tarafından azaltılmıştır. Bu çalışma sonunda ADH3 promotoru altında rekombinant olarak yüksek miktarda fitaz enzimi üretiminde P. pastoris ekspresyon sisteminin uygun olduğu sonucuna varılmıştır. Çalışmada kullanılan yöntem, farklı promotor çalışmaları için örnek niteliğinde olmuştur.