Salda gölünden izole edilen alkalifilik bakteri suşlarının siklodekstrin glukoziltransferaz (SGTaz) enzimi üretme yetenekleri ve SGTaz geni üzerine araştırmalar

Abstract

Siklodekstrin glikozil transferaz (SGTaz) enzimi siklodekstrinlerin endüstriyel üretimi amacıyla kullanılmaktadır. Ayrıca SGTaz'ın katalitik fonksiyonu bazı gıda katkı maddelerinin modifikasyonunda değerlendirilmektedir. Bu çalışma ile Türkiye'de bulunan sodalı göllerden SGTaz üretebilen suşların izolasyonu, ilgili genin izolasyonu, Pichia pastoris mayasına klonlanmasıyla rekombinant üretimi ve saflaştırılan enzimin karakterize edilmesi hedeflenmiştir. Öncelikle Salda ve Van göllerinden SGTaz üretme kapasitesine sahip yeni alkalifik bakteri suşları izole edilmiştir ve bunlar SG2, SG3, V3, SD5 şeklinde kodlanmıştır. İzolatların Gram(+) bakteriler olduğu ve 16S rDNA dizi analizi bakterilerin Bacillus cinsinden ve veri tabanlarında yer alan organizmalardan farklı olduğunu göstermiştir. İzolatlar arasından seçilen SD5 suşundan SGTaz enzimini kodlayan gen izole edilerek P. pastoris mayasına aktarılmıştır. SGTaz enzimini kodlayan gen bölgesini çoğaltmak ve/veya modifiye etmek üzere farklı primer çiftleri ile 3 farklı Polimeraz Zincir Reaksyonu (PZR) gerçekleştirilmiştir. Elde edilen DNA parçalarının gen dizisi belirlenmiş, metanol tetiklemeli protein üretimini ve proteinin hücre dışına salgılanmasını sağlayan pPICZαA vektörü ile Pichia pastoris X33 konukçu suşuna aktarılmıştır. Böylece (doğal gen dizisini içeren) N2, (gene ilave c-myc epitope ve polihistidin kuyruğu kodlayan) S3, ve (gen ve polihistidin kuyruğu kodlayan) M5 şeklinde kodlanan üç farklı rekombinant maya elde edilmiştir. Geliştirilen 3 maya suşuyla fermantasyon gerçekleştirilerek kültür sıvılarında SGTaz aktiviteleri izlenmiştir. Salgılanan rekombinant enzimlerin moleküler ağırlıklarının ~85kDa olduğu belirlenmiştir. M5 suşuyla üretilen polihistidin etiketli SGtaz enzimi afinite kromatografisiyle saflaştırılmış ve optimum aktiviteyi 50 °C'de ve pH 6'da sergilediği ve γ-β-siklodekstrin üreticisi olduğu belirlenmiştir. Enzimin, ısıl ve pH kararlılığı araştırılmış ve aktivitesini 30 dk süreyle 30-50°C, %100, pH 9'da %99,4 oranında koruduğu tespit edilmiştir.