N. Benthamiana bitkisinde aktif insan faktör IX rekombinant proteininin varyantlarının klonlanması, ekspresyonu, saflaştırılması ve karakterizasyonu

Abstract

Yürütülen bu çalışmada, insan FIX geni kodon optimize edildi, klonlandı ve N.benthamiana bitkisinde yalnız veya modifiye edilmiş enzimler, VKD-GC ve Furin ile birlikte eksprese edildi. İlaveten, bitki glikolizasyonunun bitkide üretilmiş FIX'nın aktivitesi ve stabilitesi üzerindeki spesifik etkisini çalışmak için FIX, deglikolizasyon enzimleri olan PNGase F veya Endo H ile ko-eksprese edildi. Bitkide üretilmiş FIX varyantları IMAC kolon kullanılarak kısmen pürifiye edildi ve kıyaslamalı enzimatik aktiviteleri hesaplandı. Bitkide üretilmiş ve kısmen pürifiye edilmiş FIX varyantlarının aktivitesi kromogenik yöntemle belirlendi. Sonuçlar, bitkide üretilen FIX'nın insan FIX'a kıyasla %10 göreceli aktiviteye sahip olduğunu gösterdi. Buna rağmen, yalnız üretilen ve Furin veya VKD-GC ile ko-eksprese edilen FIX proteinlerinin aktiviteleri arasında küçük farklılık ya da herhangi bir farklılık gözlemleyemedik. Furin veya Furin ve VKD-GC ile birlikte ko-eksprese edilen FIX proteininin insan FIX proteinine kıyasla yaklaşık olarak %12'lik göreceli aktiviteye sahip olduğunu gözlemledik. İlaveten, biz bitkide üretilen FIX'nın farklı varyantlarının aktivite ve stabilite analizini yaptık. FIX'nın Endo H ve PNGase F deglikolize varyantlarının insan FIX'a kıyasla göreceli aktiviteleri sırasıyla 13.6 ve 12.5'dir. FIX'nın bitkide üretilmiş glikozillenmiş ve in vivo deglikozillenmiş formlarının stabilitesi 37°C'de 24 saatlik inkübasyondan sonra belirlendi. Glikozillenmiş FIX'nın (%50'nin kalma süresi), PNGase F in vivo deglikozillenmiş ve Endo H in vivo deglikozillenmiş formlarının in vitro yarı ömrü Western blot analiziyle protein bantları analiz edilerek, sırasıyla 25.80, 37.99 ve 80.57 saat olarak hesaplandı. Bu sonuçlar FIX'nın bitkide üretilmiş Endo H in vivo deglikolize formunun glikolize FIX ve PNGase F in vivo deglikolize formuna kıyasla yüksek sıcaklıkta daha stabil olduğunu gösterdi.