Şarbon aşı adayı olarak PA83'ün yeni mutant formunun N. benthamiana bitkisinde tasarlanması, ekspsresyonu, saflaştırılması ve karakterizasyonu

Abstract

Bacillus anthracis potansiyel biyolojik savaş ajanı olarak bilindiğinden beri, güvenli, düşük maliyetli, etkinliği yüksek ve uzun süreli stabiliteye sahip şarbon aşısını geliştirebilmek oldukça yüksek önem taşımaktadır. Son yıllardaki çalışmalar yüksek ekspresyon kapasitesi ve değerli rekombinant proteinlerin güvenli, hızlı ve ucuz üretimine olanak sağlaması nedeniyle bitki temelli transient ekspresyon sisteminin umut vaad edici teknoloji olduğunu göstermektedir. B. Anthracis'in bitkide üretilen koruyucu antijeni (PA) şarbona karşı güvenli, etkili ve düşük maliyetli aşı geliştirmede büyük potansiyele sahiptir. B. Anthracis'in koruyucu antijeni glikoprotein değildir. Buna rağmen, dizisi 9 tane olası potansiyel glikolizasyon bölgesine sahiptir ve Nicotiana benthamiana bitkilerinde eksprese edildikleri zaman aşırı derecede glikozillenme gösteriyorlar. Son zamanlarda PA83 antijeninin glikozillenmemiş versiyonları, ya in vivo deglikolizasyon stratejisi (PNGase F veya Endo H temelli), (Mamedov vd. 2012; Mamedov vd. 2016; Mamedov vd. 2017) ya da mutasyon (6 tane N-glikolizasyon bölgesine yönlendirilmiş mutagenez), (Mamedov vd. 2016) yaklaşımı vasıtasıyla üretilebilmiştir. PA83'ün bu mutant formunu analiz ettiğimizde, bir önceki çalışmada mutasyon yapılmamış bölge olan fakat glikozillenme düzeyine sahip olan bir bölge olan Asn-39'u bulduk. Bu çalışmada, koruyucu antijeninin Asn-39 dahil 7 tane N-glikolizasyon bölgesinin mutasyonu ile oluşturulmuş yeni mutant formu tasarlandı, kodon optimize edildi, eksprese edildi ve N.benthamiana bitkisinde üretildi. Kıyaslama yapabilmek amacıyla PA83'ün 6 olası N-glikolizasyon bölgesinde nokta mutasyonu taşıyan versiyonu N.benthamiana bitkisinde üretildi. PA83'ün her iki mutant formu IMAC afinite kolon kromatografisi yöntemi kullanılarak saflaştırıldı ve saflaştırılmış protein stabilite analizi için değerlendirildi.