Rekombinant insülin hormonunun Pichia pastoris’te üretimi

Abstract

İnsülin pankreasın beta hücrelerinden üretilen ve vücutta glukoz dengesini sağlayan önemli bir peptit hormondur. Pankreasın yeterli miktarda insülin üretememesi ya da hücrelerin üretilen insüline cevap verememesi sonucu kan glukoz düzeyinin yükselmesiyle diyabet adı verilen metabolik bir hastalık meydana gelir. Günümüzde bu hastalığın tedavisinde insülin hormonu kullanılmaktadır. İnsülin hormonu genetik mühendisliği teknikleri kullanılarak rekombinant olarak üretilen ilk proteindir. İlk olarak Escherichia coli (E.coli) ve Saccharomyces cerevisia (S. cerevisiae)'da üretilmeye başlanmış, ancak son zamanlarda Pichia pastoris adı verilen mayanın kullanıldığı çalışmaların sayısı artmıştır. Bu çalışmada metilotrofik bir maya olan P. pastoris 'te insan insülin hormonu öncülerini(IP) kodlayan genin indüklenebilir AOX1 promotoru altında üretilmesi hedeflenmiştir. Oluşturulan klonlarla küçük ölçekte protein üretimi çalışmaları engelli erlenlerde 120 saat boyunca yapılmıştır. Engelli erlenlerde üretim çalışması esnasında belirli zaman aralıklarında alınan örneklerden elde edilen süpernatanlarda SDS-PAGE ve Western blot analizleri yapılarak protein üretimi doğrulanmaya çalışılmıştır. SDS-PAGE ve Western blot analizlerinden elde edilen sonuçlar proteinin engelli erlenlerde üretildiğini ancak üretilen proteinin hücre dışına salgılanmadığını göstermiştir. Fermentörde üretim yapıldığında ise üretilen proteinin hücre dışına salgılandığı yapılan analizlerle gösterilmiştir.