Kan-testis bariyerinin düzenlenmesinde rol alan sinyal yolaklarının araştırılması

Abstract

Kan-testis bariyerinin (KTB) yeniden modellenmesi, aktin-tabanlı hücre iskeletinin yeniden organizasyonu ile gerçekleşmektedir. Bu çalışmada, hücresel Src kinaz (c-Src) substratı olan, hücre membranı ile aktin hücre iskeletine bağlanma özelliği gösteren ve Fokal adezyon kinaz (FAK) ile aktive olduğu bilinen ezrin proteininin KTB'deki fonksiyonel öneminin gösterilmesi amaçlanmıştır. Yöntem: Primer sıçan Sertoli hücresi kültüründe in vitro olarak ve sıçan testisinde in vivo olarak RNA interferens (RNAi) aracılı ezrin yerleşimi sessizleştirilen modelde; kan-testis bariyeri bütünlüğü analizleri gerçekleştirilmiştir. KTB bütünlüğü Sertoli hücresi kültüründe, transepitelyal rezistans (TER) ölçümleri ile testiste ise fluoresan izotiyosiyanat (FITC)-inülin aracılı ajan ile değerlendirilmiştir. Ardından Sertoli hücresi lizatları ve testis lizatları elde edilerek, RT-PZR, immunoblot, immünoflüoresan ve ko-immunopresipitasyon yöntemleri ile ezrin ilişkili KTB düzenleyici proteinler araştırılmıştır. Bulgular: Ezrin yerleşiminun bazal ektoplazma özelleşmelerinde (BEÖ), seminifer epitel döngüsünün geç evre VIII'den evre IX' a kadar olan süreçte; apikal ektoplazma özelleşmelerinde (AEÖ) ise sadece evre VIII'e özgü ve basamak 19 spermatid- Sertoli arayüzünde sınırlı olduğunu gösterdik. Ezrin proteininin Sertoli hücresi kültüründe baskılanması ile aktin mikrofilamanlarının yapısındaki bozulmalar, KTB düzenleyen proteinlerin düzeylerinde ve lokalizasyonlarında değişiklikler tespit ettik. Ezrinin in vivo baskılanması ile spermatid taşınmasının geciktiğini gösterdik. Spermiyasyondaki bazı defektlere neden olan bu gecikmenin, spermatidlerin epitelin derinlerinde gömülü olması ve spermatid polaritesinin kaybına bağlı olduğu tespit ettik. Ayrıca, ezrinin atık sitoplazmalar ve fagozomlar ile ilişkili dağılım gösterdiğini, baskılandığında ise atık sitoplazmaların ve fagozomların apikalden bazal kompartmana doğru taşınmasında gecikmelere sebebiyet verdiğini ortaya koyduk. Sonuç: Ezrinin, spermatogenez sürecinde aktin mikrofilaman organizasyonun düzenlemesini etkilediğini gerek in vitro gerekse in vivo olarak gösterdik. KTB yeniden kurulumunda BEÖ ve AEÖ düzenleyici proteinlerinin lokalizasyonlarını etkileyerek spermatogenezi bozduğunu doğruladık.