E2F1 transkripsiyon faktörü’nün aktivasyonunda Protein Kinaz-A’nın rolünün araştırılması

Abstract

Adenoviral E1 ve E2 genlerinin, transkripsiyondan sorumlu olduğunun gösterilmesi ile keşfedilen E2F1 geni, 20. kromozomun uzun kolunda yer almaktadır. Translasyon ürünü ise 437 aminoasitlik bir proteindir. Dimerizasyon partneri ile dimer oluşturduktan sonra E2F1 hücre siklusunun G1 aşamasında aktif hale geçmekte ve hücre bölünmesi ile ilgili DNA Polimeraz gibi birçok sayıda genin transkripsiyonunu kontrol etmektedir. Transkripsiyonel olarak kontrol edilebilen E2F1 aktivitesinin post-translasyonel modifikasyonlar ile de kontrol edildiği görülmektedir. Translasyon sonrası E2F1, P/CAF aracılığıyla asetilasyona, Set 9 ile metilasyona ve CHK2 aracılığıyla da fosforilasyona uğrayabilmektedir. Set 9-aracılı metilasyonu E2F1'in parçalanmasına yol açarken, CHK2 ve P/CAF modifikasyonları ise metilasyonu engelleyerek proteinin stabilizasyonunu sağlamaktadır. DNA Hasarı, UV maruziyeti gibi patolojik koşullarda post-translasyonel modifikasyonlara uğrayan E2F1'in, fizyolojik koşullarda da çeşitli moleküller tarafından post- translasyonel modifikasyonlara uğratılması mümkündür. Epinefrin, adrenalin, endotelin-1 ve çok sayıda kemokin hücre fizyolojisinde hayati fonksiyonlar görürler ve etkinliklerini GPCR (G-protein coupled receptors) olarak isimlendirilen reseptörlere bağlanarak gösterirler. Bu reseptörlerin bahsedilen ligantları tarafından aktive edilmeleri durumunda pek çok yolak aktive edilir ve bu yolaklardan biri de Adenilat Siklaz dır. Aktive edilen Adenilat siklaz ATP'den cAMP oluşturur. Bunun yanı sıra cAMP seviyesi hücre içi glukoz miktarının azaldığı durumlarda da yükselir. cAMP ilk keşfedilen ikincil mesajcı olup hücrede biyolojik etkinliğini PKA enzimini aktive ederek gösterir. Aktive olan PKA biyolojik aktivitesini hedef proteinlerinde RxxS/T konsensus dizisinde yer alan Serin (S) veya Treonin (T) amino asitlerini fosforile ederek gösterir. Genel olarak hücre içi cAMP seviyesinin artmasına bağlı PKA aktivasyonu hücre proliferasyonunu negatif olarak etkiler. Bu gerçekler ışığında, aktive edilen PKA enziminin hücre döngüsünün başlamasını kontrol eden E2F1 aktivitesini negatif etkileyeceğini düşündük. Bu bilgiler doğrultusunda, E2F1'in PKA substratı olup olmayacağını görmek için E2F1'in aminoasit dizisini incelediğimizde E2F1 proteininde üç adet muhtemel PKA konsensus fosforilasyon bölgesi saptadık. Bu fosforilasyon noktaları, 127-130, 232-235 ve 361-364 pozisyonlarında lokalize olan RYET, RLLS ve RMGS amino asit dizileridir. Bu bölgelerdeki Treonin ve Serin amino asitlerinin PKA tarafından fosforile edilebileceğini ve bu fosforilasyonların E2F1 aktivitesini etkileyeceğini düşünerek ilgili amino asitlerin kodonlarını yarattığımız ökaryotik E2F1 ekspresyon vektöründe fosforile edilemeyen Alanin ve fosforilasyonu taklit eden negatif yüklü Glutamik Asit kodonlarına çevirdik. Elde ettiğimiz sonuçlara göre, PKA-aracılı E2F1 fosforilasyonunun hücre proliferasyonu, apoptozis indüksiyonu, glukoz alımı ve Sisplatin-aracılı hücre ölümüne etki ettiğini gösterdik.