Rekombinant kimozin üretiminde glikozilasyonun etkisinin araştırılması

Abstract

Kimozin enzimi peynir üretim endüstrisinde en kompleks işlem olan sütün pıhtılaştırması amacıyla kullanılan bir aspartik proteazdır. Rennet ya da rennin olarak bilinen kimozin geviş getiren hayvanların dördüncü bölümünden (şirden) elde edilir. Kimozin, sütün yaklaşık %80'ini oluşturan kazein proteininin Phe105 ve Met106 arasında bulunan peptit bağını kırarak, stabil olmayan kazein misellerini oluşturur ve sütün pıhtı oluşturmasını sağlar. Bu kimozin enzimi çeşitli bitkisel, hayvansal ve mikrobiyal kaynaklardan elde edilmektedir. Ancak bu enzimlerin pıhtılaştırma etkileri birbirinden farklı olduğu için ve hayvan kaynaklı kimozin üretiminin düşük olmasından dolayı son yıllarda rekombinant kimozin üretimi artmıştır. Rekombinant DNA teknolojisi ile gerçekleştirilen kimozin üretiminde genel olarak sığır, bufalo, keçi, manda ve deve gibi gen kaynakları kullanılmaktadır. Hayvan, bitki ve mikrobiyal kaynaklı enzimlere göre avantajlarından dolayı bu çalışmada rekombinant tibet öküzü kimozin üretimi yapılmıştır. Çalışmada Tibet öküzü (Bos grunniens) kimozin enzimi (glikozile ve glikozile olmayan formları) metilotrofik bir maya olan Pichia pastoris'te alkol oksidaz I (AOX1) promotoru kontrolü altında üretilmiştir. Kimozin enziminin glikozile (N-glikozilasyon) ve glikozile olmayan formları üretilerek glikozilasyonun rekombinant kimozin üretimine, enzimin aktivitesine ve stabilitesine etkisi araştırılmıştır. Küçük ölçekli erlenlerde yapılan 120 saatlik metanol beslemesi sonucunda glikozile ve glikozile olmayan kimozin üretiminde önemli farklılık gözlenmemiştir. Glikozile kimozin ve glikozile olmayan kimozin için enzim aktiviteleri sırasıyla 55 IMCU/ml ve 61 IMCU/ml olarak hesaplanmıştır. Fermentör ölçekli üretim (5L) gerçekleştirildiğinde ise glikozile ve glikozile olmayan kimozin için enzim aktiviteleri sırasıyla 214.3 IMCU/ml ve 257.14 IMCU/ml olarak hesaplanmıştır.Enzimin optimum çalışma şartları da pH 6 ve 40C olarak tespit edilmiştir. Ticari maya ile rekombinant kimozin enzimleri verimi arasında önemli bir farklılık olmadığı gözlenmiştir. Bu çalışma sonunda peynir endüstrisinde artan kimozin enzimi ihtiyacının karşılanması için enzimin rekombinant olarak üretimine P. pastoris ekspresyon sisteminin oldukça uygun olduğu sonucuna varılmıştır.