Renal transplant alıcılarında proteomik yöntemlerle yeni biyobelirteçlerin araştırılması

Abstract

Renal transplantasyon, son dönem böbrek hastalığının tedavisinde en iyi seçenektir. Renal allogreft biyopsi rejeksiyonun tanısında referans yöntemdir. Ancak invaziv doğası nedeniyle, rejeksiyonun erken tanısını sağlayan yeni klinik ve biyokimyasal belirteçler böbrek nakli bir öncelik olmuştur. İdrar karaciğer- yağasidi bağlanma proteini (L-FABP) insan böbrek transplant hastalarında renal iskeminin umut vadeden erken bir biyobelirteci olarak değerlendirilmektedir. Netrin-1 renal transplantasyon sonrası akut böbrek hasarının (AKI) yararlı bir erken diagnostik biyobelirteci olabilir. Klinik pratikte L-FABP ve netrin-1 kullanımının bu biyobelirteçler ile özgüllük, doğruluk ve sağlamlığı birleştiren bir analitik yöntem ile ilişkili olması gerekir. Bu çalışmada renal transplantasyon hastalarında idrar L-FABP ve netrin-1 düzeylerini ölçmek için tandem kütle spektrometresi-ultra hızlı sıvı kromatografisi (LC-MS/MS) kullanılarak optimize edilmiş çoklu reaksiyon izleme (MRM) yöntemini geliştirmeyi amaçladık. Rekombinant insan L-FABP ve netrin-1 triptik standartları, Matriks Destekli Lazer Desorpsiyon İyonizasyon- uçuş zamanlı kütle spektrometre (MALDI TOF) MS/MS ve LC-MS/MS cihazlarında, kantitasyon amacıyla MRM metodu geliştirmede kullanılacak peptidlerin seçimi için analiz edildiler. L-FABP ve netrin-1'in kütle spektrometrik analizinden önce, renal transplant alıcılarından alınan idrar örneklerinde izolasyon, konsantrasyon, çöktürme ve triptik kesim işlemleri yapıldı. Netrin- ve L-FABP düzeyleri hem serum hem de idrar örneklerine enzim immunoassay ile ölçüldü. LC-MS/MS analizleri için L-FABP kantitasyonunda en iyi sinyal MH+ of 50FTITAGSK57 (m/z 824) triptik peptidinden sağlandı. MALDI-TOF MS/MS spektralarından elde edilen 50FTITAGSK57 MH+ iyonunun, çarpışma indüklü parçalanması (CID) sonucunda belirlenen y3 fragment iyonu kantitatif MRM metodu için kullanıldı. Benzer bir şekilde netrin-'in LC-MS/MS kantitasyonu için 270DSYFYAVSDLQVGGR284 MH+2 (m/z 839) iyonu en iyi sinyali sağladı. MALDI-TOF MS/MS spektralarından elde edilen 270DSYFYAVSDLQVGGR284 MH+2 iyonunun, çarpışma indüklü parçalanması (CID) sonucunda belirlenen y8, y9, ve y11 fragment iyonları kantitatif MRM metodu için kullanıldı. Serum L-FABP ve netrin-1 düzeyleri ELISA ve LC-MS/MS metodları ile ölçüldü. Serum örneklerinde transplantasyon öncesi ve sonrasında her iki protein için herhangi bir fark gözlemlenmedi. ELISA ile analiz edilen idrar L-FABP düzeyleri transplantasyon sonrası anlamlı düzeyde artmış bulundu. LC-MS/MS ile ölçülen transplantasyon sonrası idrar L-FABP ve netrin-1 anlamlı derecede yüksek bulundu. İki metod arasındaki sperman korelasyon katsayısı istatistiksel olarak anlamlı bulundu. Gün içi ve günler arası ölçümlerin varyasyon katsayıları LC-MS/MS analizinin validasyonu için yüksek tekrarlanabilirlik sağladı. L-FABP ve netrin-1'in LC-MS/MS ile kantitasyonu insan böbrek transplant hastalarında bu potansiyel biyobelirteçlerin değişimlerini belirlemek için yeni referans metod olarak kullanılabilir.