Fenilketonüri ve kistik fibrozis kalıtsal hastalıklarında kodlayıcı bölge mutasyonlarını taramak için SSCP yönteminin kullanılması

Abstract

İnsan genomunun şifresi her geçen gün biraz daha çözümlenmektedir. Hastalık patolojilerinde rol oynadığı bilinen genler izole edildikçe, hastalığa sebep olan mutasyonların taranmasında kullanılabilecek hızlı, ucuz ve kolay tekniklere olan ihtiyaç da artmaktadır. Tek zincir konformasyon polimorfizm (SSCP) analizi bu amaçla geliştirilmiş teknikler arasında en çok kullanılan tekniklerden biridir. Büyük bir gen, SSCP kullanılarak, bilinen ve bilinmeyen mutasyonlar açısından taranabilir. SSCP tekniği hızlı, kolay uygulanabilir ve ucuz olması ile radyoaktif olmayan bir teknik olarak da kullanılabilmesi açısından avantajlıdır. Kistik fibrozis (KF) ve fenilketonüri, Türk populasyonunda en sık görülen kalıtsal hastalıklardan ikisi olup, yüksek genetik heterojeniteye sahiptirler. Bu nedenle, genotipleri önceden belirlenmiş hastalardan elde edilen DNA örnekleri kullanılarak gümüş boyama yöntemi ile PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu), SSCP analizi laboratuvar şartlarına göre optimize edildi. Çalışmamızda fenilketonüri için R261Q ve IVS10 mutasyonlarmı taşıyan 4, kistik fibrozis için AF508 ve ATA mutasyonlarını taşıyan 5 olgu olmak üzere heterozigot, homozigot ve normal genotipe sahip birer bireyin örnekleri çalışıldı. Farklı koşulların denenmesi sonucunda PAH(Fenilalanin Hidroksilaz) geninin 7.eksonunda bulunan R261Q mutasyonu için, % 5 gliserol içeren % 10'luk (39:1 akrilamid:bisakrilamid oranıyla) jelde 600 V sabit voltaj farkında oda ısısında 5.5 saat yürütüldüğünde, aynı genin 10. intronunda bulunan IVS10 mutasyonu için ise aynı şartlarda fakat 79:1 oranında akrilamid:bisakrilamid bulunduran SSCP jelinde yürütüldüğünde bant kayması en iyi saptandı. KF hastalığına sebep olan CFTR (Kistik Fibrozis Transmembran Regülatör) geni 10. eksonunda bulunan AF508 ve ATA mutasyonları için ise, en iyi sonuç 39:1 oranında akrilamid:bisakrilamid bulunduran % 10'luk jelde % 5 gliserol oranı +4 ° C'de 750 V sabit voltaj farkı olarak belirlendi.