D-Sorbitol kullanılarak nadir şekerlerden L-Sorbozun fermentasyonla üretim imkanlarının araştırılması

Abstract

L-sorboz, C6H12O6 kapalı formülüne sahip ketoz bir monosakkarittir. Doğada nadir bir şeker olarak doğal kaynaklarda oldukça düşük miktarda bulunan L-sorboz yaygın olarak Gluconobacter veya Acetobacter türleri kullanılarak D-sorbitolün mikrobiyal oksidasyonu yoluyla üretilmektedir. L-sorbozun gıda endüstrisinde en önemli kullanım alanı C vitamini sentezinde başlangıç veya ara materyal olarak kullanımı olup, dünya genelinde üretilen L-sorbozun çoğunluğu C vitamini üretiminde kullanılmaktadır. Bu tez çalışmasında, Gluconobacter oxydans ATCC 621 suşu kullanılarak D-sorbitolden fermantasyon ile L-sorboz üretimi üzerine etkili olan fermantasyon koşullarının optimize edilmesi amaçlanmış ve optimizasyon işlemi çalkalamalı inkübatör ve biyoreaktör ölçeğinde olmak üzere iki aşamalı olarak gerçekleştirilmiştir. Çalışmanın ilk aşamasında; çalkalamalı inkübatörde L-sorboz üretimi üzerine etkili olan D-sorbitol konsantrasyonu, besiyeri başlangıç pH değeri, sıcaklık ve çalkalama hızı parametrelerinin yanıt yüzey metodu kullanılarak optimize edilmesi amaçlanmıştır. Fermantasyon koşullarının optimizasyonu için bağımsız değişkenlerin sınır değerleri; D-sorbitol konsantrasyonu için 90 ila 170 g/L, başlangıç pH değeri için 6 ila 8, sıcaklık için 25 ila 35°C ve çalkalama hızı için 150 ila 250 rpm olarak belirlenmiştir. Belirlenen parametreler ile merkezi kompozit tasarım istatistik yöntemi ile orta noktanın 3 kere tekrarlandığı toplam 27 üretimlik bir deneme deseni kullanılmıştır. Fermantasyon süresince yapılan örneklemeler ile optik yoğunluk, D-sorbitol ve L-sorboz miktar analizleri yapılmıştır. Çalkalamalı inkübatörde gerçekleştirilen tüm fermantasyon denemeleri sonunda L-sorboz üretim miktarı üzerine; D-sorbitol konsantrasyonunun, başlangıç pH değerinin, sıcaklığın, D-sorbitol konsantrasyonu-sıcaklık, pH-sıcaklık ve sıcaklık-çalkalama hızı interaksiyonlarının ve D-sorbitol konsantrasyonu, pH değeri ve çalkalama hızı karelerinin önemli (p<0.01; 0.010.05) bir etkisinin olmadığı tespit edilmiştir. Çalkalamalı inkübatör denemeleri sonucunda L-sorboz üretimi için optimum fermantasyon koşulları 127.58 g/L D-sorbitol konsantrasyonu, 7.20 besiyeri başlangıç pH değeri, 35°C sıcaklık ve 224 rpm çalkalama hızı olarak belirlenmiştir. Belirlenen optimum koşullarda gerçekleştirilen 168 saatlik doğrulama fermantasyonuyla %89.95 dönüşüm oranı ile L-sorboz üretimi gerçekleştirilmiştir. Çalışmanın ikinci aşamasında; çalkalamalı inkübatörde gerçekleştirilen fermantasyon denemeleri sonucu elde edilen optimum koşullar kullanılarak, 1.5 L çalışma hacminde ve 700 rpm karıştırma hızında biyoreaktörde 0.5, 1.0 ve 1.5 vvm hava akım koşullarında 1x3 faktöriyellik yeni bir deneme gerçekleştirilmiş ve 118 saat süren fermantasyonlar boyunca elde edilen örneklemeler ile belirlenen optik yoğunluk, biyokütle, D-sorbitol ve L-sorboz miktar verileri ile fermantasyonlara ait kinetik parametreler hesaplanmıştır. Farklı hava akım hızlarında gerçekleştirilen denemeler sonucunda, L-sorboz üretim miktarı üzerine hava akım hızının önemli (p<0.01) seviyede etkili olduğu tespit edilmiştir. Biyoreaktör denemeleri sonucunda optimum hava akım hızı %98.33 verim ile en yüksek miktarda L-sorboz üretiminin gerçekleştirildiği 1.5 vvm hava akım hızı olarak belirlenmiştir. Gerçekleştirilen tüm biyoreaktör denemelerinde ortamın pH değeri takip edilmiş ve fermantasyon ortamının pH değeri 5 değerinin altına düşmeden L-sorboz üretiminin başlamadığı ve L-sorboz üretiminin ancak 72 ila 95 saat kadar sonra başladığı tespit edilmiştir. Fermantasyon süresi üzerine besiyeri başlangıç pH değerinin etkisi göz önünde bulundurularak belirlenen optimum koşullar, besiyeri başlangıç pH değeri 7.2 ve 5.0 olan iki farklı üretim ile doğrulanmıştır. Doğrulama fermantasyonları sonucunda her iki pH değerinde L-sorboz üretim veriminin neredeyse eşit ve ortalama %99.36 olduğu ancak başlangıç pH değeri 7.2 olan üretim 118 saat sürerken, başlangıç pH değeri 5.0 olan üretimin 56 saat gibi kısa bir sürede tamamlandığı belirlenmiştir. Tüm sonuçlar birlikte değerlendirildiğinde ise biyoreaktörde 700 rpm karıştırma hızında D-sorbitolden L-sorboz üretimi için optimum koşulların; 127.58 g/L besiyeri başlangıç D-sorbitol konsantrasyonu, 5 başlangıç pH değeri, 35°C fermantasyon sıcaklığı ve 1.5 vvm hava akım hızı olduğu ve bu optimum koşullarda 56 saatte, %99.21 verim ile L-sorboz üretilebildiği tespit edilmiştir. Bu çalışma ile Türkiye'de ilk kez C vitamini üretim amaçlı L-sorboz üretimi de gerçekleştirilmiştir.