İnülinaz enziminin fermentasyonla üretiminde inhibitör bileşiklerin etkisi

Abstract

Biyoteknolojik yöntemlerle inülinaz gibi katma değeri yüksek ürünlerin üretiminde son zamanlarda saf karbon kaynaklarının kullanımına alternatif olarak lignoselülozik kaynakların kullanımına ilgi artmıştır. Ancak söz konusu kaynakların karbon kaynağı olarak kullanılabilmesi için uygulanan çeşitli ön işlemler sonucunda fermentasyon ortamını etkileyecek inhibitörler oluşmaktadır. Bu aşamada son ürün üretiminde kullanılacak mikroorganizmanın inhibitör bileşiklere karşı hassasiyetinin bilinmesi oldukça önem taşımaktadır. Bu çalışmada inhibitör olarak farklı konsantrasyonlarda HMF (1.0-6.0 g/L), furfural (0.1-2.0 g/L), fenol (0.1-5.0 g/L), asetik asit (2.5-12.5 g/L) ve formik asit (1.5-7.0 g/L) kullanılarak Aspergillus niger A42 (ATCC® 204407) ile inülinaz fermentasyonları gerçekleştirilmiştir. Her bir inhibitör için en iyi Iase aktivitesinin elde edildiği fermentasyonlara 10 farklı matematiksel model (MGM, MLM, MRM, Stannard, Weibull, MMF, Asimetrik, Baranyi, Huang, Fitzhugh) uygulanmıştur. Ayrıca tüm denemelerin sonuçları incelendikten sonra lignoselülozik materyalden gelmesi muhtemel tüm inhibitörleri içeren karışım fermentasyonunun sinerjist etkisini incelemek için Placket-Burman Dizayn kullanılmıştır. Çalışmanın son aşamasında ise arpa kavuzu, yulaf kavuzu, buğday kepeği ve çavdar kepeği hidrolizatları sülfürik asit ile hidroliz edilmiş ve hidrolizatlarda inhibitör bileşen tayini yapılmıştır. Hidrolizatlar detoksifiye edilmeden fermentasyon sıvısı olarak kullanılmış olup inülinaz fermentasyonları gerçekleştirilmiştir. Fermentasyon denemeleri sonucunda her inhibitör bileşik için en yüksek ve en düşük Iase aktivitesi HMF için 268.74 U/mL (1 g/L HMF), 62.76 U/mL (6 g/L HMF) furfural için 197.35 U/mL (0.1 g/L furfural), 5.14 U/mL (1.0 g/L furfural), fenol için 117.39 U/mL (0.1 g/L fenol), 12.57 U/mL (5 g/L fenol), asetik asit için 340.32 U/mL (2.5 g/L), 3.24 U/mL (12.5 g/L) ve formik asit için 136.83 U/ml (1.5 g/L formik asit), 312.69 U/mL (7 g/L formik asit) olarak bulunmuştur. Iase aktivitesinin en yüksek olduğu fermentasyonlara 10 farklı model uygulanmıştır. Modeller, model parametreleri (RMSE, MAE, AF, BF, R2) yardımıyla kıyaslanmış olup HMF ilavesiyle gerçekleştirilen fermentasyon için Stannard, furfural için Weibull, fenol için MGM, asetik asit için Huang ve formik asit için Weibull inülinaz üretimi açısından en uyumlu modeller olarak belirlenmiştir. İnhibitörlerin sinerjist etkisinin incelenmesi amacıyla Plackett-Burman Dizayn (PBD) ile inhibitörlerin karışım fermentasyonlarının optimizasyonunda tüm inhibitörlerin minimum (3.0 g/L HMF, 0.1 g/L furfural, 0.1 g/L fenol, 2.5 g/L asetik asit ve 3.0 g/L) konsantrasyonda olduğu fermentasyonda (3 numaralı deneme) 215.77 U/mL Iase aktivitesi tespit edilmiştir. Optimum karışım fermentasyonuna ait Iase aktivitesinin kontrol fermentasyonundan istatistiksel olarak da farklı olmadığı görülmüştür (P>0.05). Çalışmanın son aşamasında ise arpa kavuzu, yulaf kavuzu, buğday kepeği ve çavdar kepeğinin seyreltik asit ile hidrolizi ile inülinaz fermentasyonları gerçekleştirilmiş olup Iase aktivitesi sırasıyla 202.29, 42.03, 244.13 ve 254.60 U/mL olarak bulunmuştur. Bu çalışma sonucunda Aspergillus niger A42 (ATCC® 20447)'nin farklı inhibitör (HMF, furfural, fenol, asetik asit ve formik asit) konsantrasyonlarına karşı tolerans aralıkları belirlenmiştir. Böylece mikroorganizmanın, lignoselülozik materyallerin işlenmesiyle açığa çıkması muhtemel inhibitör konsantrasyonlarına karşı tepkisi ortaya konmuştur. Ayrıca PBD ile gerçekleştirilen karışım fermentasyonları ile mikroorganizmanın tolere edebileceği inhibitör karışımı optimize edilmiştir (3.0 g/L HMF, 0.1 g/L furfural, 0.1 g/L fenol, 2.5 g/L asetik asit ve 3.0 g/L). Arpa kavuzu, çavdar kepeği ve buğday kepeği hidrolizatlarındaki inhibitör bileşik konsantrasyonlarını mikroorganizmanın tolere edebildiği ve detoksifikasyon işleminin gerek olmadığı ortaya konmuştur. Bu tez çalışması kapsamındaki gerçekleştirilen tüm fermentasyonların lignoselülozik maddeler ile gerçekleştirilecek fermentasyonlarda detoksifikasyon gibi proseslerin gerekliliğine karar verme aşamasında önemli olacağı düşünülmektedir.