N. Benthamiana’da üretilmiş insan FIX’nın hafif ve ağır zincirlerinin tasarlanması, üretimi ve karakterizasyonu

Abstract

Hemofili B kandaki faktör IX proteini eksikliğine neden olan X kromozomu mutasyonunun neden olduğu kalıtsal bir hastalıktır. Faktör IX proteini aktive olmak için iki aşamalı proteolitik kesime maruz kalmaktadır. Arg145 bölgesinde ki kesilme ile iki zincirli inaktif FIXa oluşur. Bu işlemin ardından Arg180 bölgesinde hidroliz meydana gelir ve hafif zincir (LC) içeren N-terminal ile ağır zincir (HC) içeren C-terminal arasında disülfit bağları oluşarak aktif proteaz Faktör IXab meydana gelir. Aktif Faktör IX, dört yapısal domain içerir: N-terminustan başlayarak γ-karboksiglutamik asit (Gla) domaini, iki tane epidermal büyüme faktör-benzeri domain ve son olarak proteolitik domainidir. Halen, hemofili B'li hastalar ya insan kanından plazmada FIX elde edilerek ya da CHO (Çin hamsteri yumurtalık) hücrelerinde üretilen rekombinant FIX'le tedavi edilmektedir. Bununla birlikte, bu sistem son derece pahalı ve ölçeklendirilmesi zor bir sistemdir. Bitki ifade sistemi ise umut verici bir ifade yöntemi olmuştur ve diğer ifade sistemlerine kıyasla birtakım avantajlara sahiptir. Bu çalışmanın amacı, in vivo olarak bağlanması mümkün olmak üzere bitkide geçici gen ekspresyon sistemi kullanılarak faktör IX'un hafif ve ağır zincir domainlerinin üretimini denemektir. Bu çalışmada, HC ve LC genleri N. Benthamiana kodonları kullanılarak tasarlanmış ve kodon optimizasyonu yapılmıştır. Kodon optimizasyonu yapılmış HC ve LC genleri sentezlenmiş ve daha sonra bitki ekspresyon vektörüne klonlanmıştır. Klonlanmış plazmidler, elektroporasyon yoluyla Agrobacterium tumefaciens'in soyu olan AGL1'e aktarılmıştır. Nicotiana benthamiana bitkileri, HC ve LC genlerini barındıran agro ile infiltre edilmiştir. Ekspresyon ve optimizasyonun onaylanmasından sonra her iki gen, HC ve LC'nin muhtemel bağlanmaları için agro-infiltrasyon yoluyla bitki hücrelerine aktarılmıştır. LC ve HC genleriyle infiltre edilen bitki toplanıp, ekstre edilmiş ve saflaştırılmıştır. Son olarak FIX aktivitesi gerçekleştirilmiştir. Aktivitenin, insan Furine göre %10'dan daha yüksek olmadığı saptanmıştır.