N. benthamiana’da P. falciparum PFS48/45 R0.10C varyantlarının tasarlanması, üretimi ve karakterizasyonu

Abstract

Günümüzde sıtmaya karşı birçok aşı geliştirilme aşamasında olmasına rağmen yeterli derecede koruma sağlayan etkili bir aşı henüz bulunmamaktadır. Doğal Pfs48/45 proteini Nbağlı glikan taşımamaktadır, fakat bitki ekspresyon sistemleri de dahil olmak üzere herhangi bir ökaryotik sistemde anlatımı yapıldığında anormal şekilde glikosilasyona uğrayan yedi potansiyel N-bağlı glikosilasyon bölgesi içermektedir. Anormal glikosilasyon problemini çözmek için geçici gen anlatımı yöntemi aracılığıyla N. benthamiana da ilgili hedef gen ile bakteriyel deglikosilasyon enzimleri olan PNGase F (Mamedov vd. 2012; Mamedov vd. 2013; Mamedov vd. 2016) veya Endo H enzimlerinin (Mamedov vd. 2017) birlikte ekspresyonu stratejisi geliştirildi. Bu çalışmada, geçici gen anlatımı yöntemi ile N. benthamiana bitkisinde Pfs48/45 proteininin 10C domaininin farklı versiyonları (glikosillenmiş ve deglikosillenmiş) başarılı bir şekilde üretildi. Üretilen 10C varyantları saflaştırıldı ve karakterize edildi. Pfs48/45-10C varyantlarının MRA-26 antikorları (iletim bloklama antikoru olarak bilinen bir konformasyonel spesifik antikor) kullanılarak gerçekleştirilen western blot analizleri, indirgenmemiş anormal şekilde glikosilasyona uğramış Pfs48/45-10C proteininin MR-26 antikoru tarafından çok az ya da hiç tanınmadığını; bitkide PNGase F veya Endo H in vivo olarak üretilen indirgenmemiş deglikosile Pfs48/4510C proteininin antikorlar tarafından güçlü bir şekilde tanındığını göstermiştir. Bu sonuçlar bitkide Endo H veya PNGase F aracılığıyla in vivo deglikosilasyona uğramış Pfs48/45-10C proteinlerinin doğru katlandığını ve Pfs48/45-10C proteinlerinin doğal Pfs48/45 proteini üzerinde bulunan epitopları içerdiğini desteklemektedir. Elde edilen sonuçlar, bitkide üretilmiş Endo H in vivo deglikosillenmiş Pfs48/45 ve Pfs48/45-10C antijenlerinin Pfs48/45 tabanlı iletim bloklama sıtma aşısının geliştirilmesi için potansiyele sahip olduğunu desteklemektedir.