Abstract:
Bu çalışmada, Karpuz Bakteriyel Meyve Leke hastalık etmeni Acidovorax citrulli (Acidovorax avenae subsp. citrulli)' nin Real-Time PCR ile hassas tanısı ve bitki dokularından tespiti için primer ve prob setleri geliştirilmiştir. Karpuz ve kavun çeşitlerinin hastalığa karşı duyarlılık reaksiyonları araştırılmıştır. Acidovorax citrulli'nin Real-Time PCR ile tanısı ve tespiti için hrpB2 gen dizisini ve ITS (Internally Transcribed Spacer) bölgesini kullanarak her iki bölgeye özel primer dizayn edilmiştir. 8 bazdan oluşan LNA (Locked Nucleic Acid) probe geliştirilmiştir. Geliştirilen primer ve prob setlerinin spesifikliği; farklı Acidovorax citrulli strainleri, farklı bitki patojeni bakteriler ve karpuz genomik DNA'sı kullanılarak test edilmiştir. Test edilen tüm yerli ve yabancı Acidovorax citrulli izolatlarında her iki primer-prob seti 88 bp'lik amplifikasyon gerçekleşirken, farklı bitki patojeni bakterilerde ve karpuz genomik DNA'sında hiçbir amplifikasyon tespit edilmemiştir. Bu çalışmada bakteriyel hücre hassasiyet sınırı 2 bakteriyel hücre ve DNA düzeyindeki hassasiyet sınırı ise 12 fg'dır. Hastalığa etki eden bakteri popülasyonlarının sayısını belirlemek için Kantitatif Real-Time PCR ve hastalıklı bitki materyali üzerinde yaşayan bakterilerin saptanması için Bio-PCR gerçekleştirilmiştir. Kantitatif Real-Time PCR sonucunda her iki primerprob seti için standart eğri elde edilmiştir. Kantitatif Real-Time PCR yönteminde kullanılan hrpB2 ve ITS primer-prob setlerinin etkinlikleri sırasıyla % 97.941 ve % 98.215 oranlarında yüksek güvenirlikte bulunmuştur. Bu çalışmada geliştirilen Real- Time PCR metotları bakteriyel patojenin varlığı açısından karpuz ve kavun tohumlarının taranmasına yardımcı olabilecektir. Ayrıca bu metot bakteriyel patojenin direkt hastalıklı bitki materyalinden ve direkt bakteriyel hücreden tanı ve tespitine yardımcı olabilecektir. Bu güvenilir, hassas ve tekrarlanabilir gerçek zamanlı PCR yöntemi, potansiyel inokulum kaynaklarının kontrol edilmesine ve alandaki bakteriyel patojenlerin yayılmasının önlenmesine yardımcı olabilecektir. Karpuz ve kavun çeşitlerinin Acidovorax citrulli'ye karşı duyarlılık reaksiyonları, dokuz farklı ölçeklendirmeye göre değerlendirilmiştir. Test edilen bitkilerin duyarlılık reaksiyonları istatistiki olarak anlamlı bulunmamıştır.
