Chlamydomonas reinhardtii fosfoenolpirüvat karboksikinaz 1 geninin A ve B kesim varyantlarının izolasyonu, karakterizasyonu ve Escherichia coli’de heterolog ekspresyonu

Abstract

Yürütülen bu çalışmada, alglerde yağ oranı seviyesiyle ilişkili olduğu düşünülen Pck1 geninin Chlamydomonas reinhardtii'den klonlanması, ilk defa olarak tanımlanması, karakterizasyonu ve ekspresyon analizlerinin yapılması amaçlanmıştır. Elde edilen bulgular, bir sonraki çalışmalarda alglerde yağ oranının arttırılarak, alglerden endüstriyel olarak yüksek verimli yağ elde edilmesi amacıyla kullanılabilecektir. Yapılan analizlerde, Chlamydomonas reinhardtii 2137 (CC-4886) suşu kaynak olarak kullanılmıştır. Mikroalgler, sabit sıcaklık ve ışıklı ortam şartlarında TAP besiyerinde büyütülmüştür. Moleküler analizler, mikroalg kütlesinin sıvı azot yardımıyla ekstrakte edilmesiyle elde edilen nükleik asit ve proteinlerle yapılmıştır. Pck1 geninin, Pck1a ve Pck1b olmak üzere, iki farklı alternatif kesimi vardır, her iki kesim varyantı, PZR amplifikasyonları ile elde edilmiş ve E. coli'ye klonlanarak, enzim aktivasyon ölçümleriyle aktiviteleri belirlenmiştir. Ayrıca SDS-PAGE ve Western Blot yöntemleriyle de proteinlerin boyutları gösterilmiştir. Mikroalg hücreleri TAP besiyerinde farklı azot ve karbondioksit oranlarında büyütülmüş, besiyerinde azalan azot oranlarıyla beraber enzim aktivitesinin azalmasıyla, PCK1 enziminin susuturlması halinde algal yağ oranının artabileceği gösterilmiştir. Karbondioksit oranı arttıkça enzim aktivitesinin arttığının saptanmasıyla da PCK1 enziminin fotosentetik bir enzim olabileceği gösterilmiştir, bu şekilde model bir organizma olan Chlamydomonas reinhardtii'de fotosentez sisteminin anlaşılmasına katkı sağlanmıştır. Ayrıca Pck1'in fotosentez sistemiyle ilişkili olması, susturulmasının algal yağ oranının artımına sebep olacağının diğer bir işareti olarak ortaya koyulmuştur. PCK1 enziminin, mikroalglerde aktif bir enzim olduğunun gösterilmesi ve alglerde hücresel yağ oranıyla ilişkisinin ortaya çıkarılmasıyla, alglerde yağ oranının artırılmasına yönelik yapılacak çalışmalara önemli bir katkıda bulunulmuştur. Ayrıca bir model organizma olan Chlamydomonas reinhardtii'de fotosentez sistemiyle ilgili bu karakterizasyonun yapılması, bu çalışmayı referans alarak, diğer yakın türlerde ilgili enzim genlerinin karakterizasyonunun yapılması yönünde bir başlangıç olmuştur.