Önemli pankreatik transkripsiyon faktörlerinin sentetik mRNA’larının dizaynı, İN VİTRO üretimi ve Beta hücresi farklılaşmasındaki rollerinin incelenmesi

Abstract

Diyabet tedavisinde kullanımının mümkün olmasından dolayı pankreatik beta hücresi programlama büyük bir ilgi görmüştür. Çeşitli çalışmalarda, viral vektörler aracılığıyla, önemli pankreatik transkripsiyon faktörlerinin somatik hücrelerde yüksek ekspresyonu sonucunda somatik hücrelerden insülin sentezleyebilen beta hücresi programlanabildiği gösterilmiştir. Ancak viral vektörlerin kullanımındaki kaygılar, genin ekpresyonu ve hücre içine taşınımı konusunda bilim insanlarını yeni arayışlara sokmuştur. mRNA'ların in vitro sentezi ve transfeksiyonu gen ekpresyonu için güvenli bir yöntemdir. Bu tez çalışmasında önemli insan pankreatik transkripsiyon faktörleri olan Pdx1, Ngn3 ve MafA mRNA'larının dizaynı ve in vitro üretimi yapılmıştır. Ayrıca yapılan çalışmada bu mRNA'ların ekpsresyon verimi hücre kültüründe gösterilmiştir. Yapılan çalışmada öncelikle ilgili genlerin Açık Okuma Çerçeveleri (ORF) ile modifiye edilmiş 5′ ve 3′ UTR'ların ligasyonu yapılmıştır. Ligasyon ürünü plazmite klonlanmış ve in vitro transkripsiyon için hazır hale getirilmiş, in vitro transkripsiyon yapılmıştır. Oluşturulan modifiye mRNA'ların kalitatif ve kantitatif analizleri yapılmış ve proteine translasyon verimleri incelenmiştir. In vitro transkripsiyonu yapılan mRNA'ların insan fibroblast hücrelerine başarılı bir şekilde transfekte edildiği gösterilmiştir. Translasyon sonucu oluşan proteinlerin nükleusta doğru bir şekilde lokalize olduğu gösterilmiştir. Sonuç olarak, dizayn edilen ve in vitro üretilen bu önemli pankreatik transkripsiyon faktörlerinin hücre programlama çalışmalarında kullanılabileceği gösterilmiştir.