Asmada (Vitis vinifera) taç gali hastalık etmeni Rhizobium vitis’in LNA probe kullanılarak Real-Time PCR ile tanısı ve tespiti

Abstract

Bu çalışmada, asmada (Vitis vinifera) önemli kayıplara neden olan Taç Gali hastalık etmeni Rhizobium vitis'in LNA (Locked Nucleic Acid) prob kullanılarak hem direkt bakteri hücresinden hem de hastalıklı bitki dokularından Real-Time PCR yöntemi ile hassas ve seçici olarak tanısı ve tespiti gerçekleştirilebilmiştir. Oktopin katabolize eden ve Rhizobium vitis strainlerine ait ocs (oktopin sentaz) geninin 475 bç'lik kısmı, nopalin katabolize eden nos (nopalin sentaz) geninin 394 bç'lik kısmı klasik PCR ile çoğaltılmış, PCR ürünlerinin dizi analizi gerçekleştirilerek Real-Time PCR için primer ve prob setleri geliştirilmiştir. Vitopin katabolize eden Rhizobium vitis strainlerine spesifik primer ve prob setleri ise, vis (vitopin sentaz), vitopin iaaM (indol asetik sentaz) ve vitopin virD2 genlerine ait gen bankasındaki diziler kullanılarak geliştirilmiştir. Geliştirilen primer setleri ve probların spesifikliği, farklı Rhizobium vitis strainleri, farklı bitki patojeni bakteriler, asma genomik DNA'sı, baz materyal ve tümör dokularından hazırlanan süspansiyonlar kullanılarak test edilmiştir. Oktopin ve nopalin katabolize eden Rhizobium vitis strainlerinde sırasıyla, 62 ve 78 baz çifti uzunluğunda DNA fragmentleri çoğaltılabilmesine rağmen, farklı bitki patojeni bakterilerde ve asma genomik DNA'sında hiçbir amplifikasyon meydana gelmemiştir. Oktopin ve nopalin katabolize eden Rhizobium vitis strainlerinin tanıları ve tespitleri, bu çalışmada geliştirilen primer ve prob setleri kullanılarak Real-Time PCR yöntemi ile 20-25 dakikada gerçekleştirilebilmiştir. Oktopin ve nopalin straini için geliştirilen Real-Time PCR yönteminin bakteriyel hücre hassasiyet sınırı 1 bakteri hücresi olarak belirlenmiştir. Oktopin ve nopalin strainleri için DNA düzeyindeki hassasiyet sınırı ise 10 pg olarak tespit edilmiştir. Rhizobium vitis'in enfekteli asma baz materyalinden elde edilen bitki özsuyundan ve tümör dokularından hazırlanan süspansiyonlardan tanı ve tespiti gerçekleştirilmiştir. Sonuç olarak, Taç Gali hastalık etmeni, Rhizobium vitis'in oktopin, nopalin ve vitopin katabolize eden strainlerinin her birine özel geliştirilen primer ve prob setleri ve Real-Time PCR yöntemi kullanılarak hem direkt bakteriyel hücreden, hem asma bitki özsuyundan, hem de asma ve domates tümör dokularından hızlı ve hassas bir düzeyde tanı ve tespitlerinin yapılabileceği ortaya çıkarılmıştır.