Pichia pastoris alkol oksidaz (AOX1 ve AOX2) genlerinin inaktif edilmesi ve elde edilen suşun rekombinant protein üretiminde kullanılması

Abstract

Pichia pastoris, biyoteknoloji, ilaç endüstrisi ve akademik araştırmacılar tarafından rekombinant protein üretimi için ihtiyaç duyulan bir ekspresyon sistemidir. P. pastoris, bakteriler gibi, tek karbon kaynağı olarak metanol, glukoz, gliserol veya etanol içeren ucuz besiyerlerinde hızla gelişme gösterebilmektedir. Ayrıca, insanlar gibi, ökaryotik bir organizmadır ve böylece hücre içi ortamı ökaryotik proteinlerin katlanması bakterilere göre daha iyi olanak sağlamaktadır. Buna ilaveten proteolitik işlemler, disülfit köprüsü oluşumu ve glikozilasyon gibi translasyon sonrası modifikasyonları gerçekleştirme yeteneğine sahiptir.P. pastoris'in genomunda alkol oksidaz geninin iki kopyası bulunmaktadır. AOX1 geni hücrede alkol oksidaz aktivitesinin %85'inin regülasyonundan sorumlu iken, AOX2 geni alkol oksidaz aktivitesinin %15'inden sorumludur. Bu sebeple, rekombinant protein üretiminde AOX1 promotoru daha yaygın olarak kullanılmaktadır. Metanol kullanım yeteneklerine göre 3 tip P. pastoris konukçu suşu bulunmaktadır. Çoğu suş metanolde doğal tip oranında gelişir (Mut+, metanol kullanımı pozitif fenotip). Diğer konukçu suşların (Muts ve Mut-) bir veya iki AOX geni de silinmiştir. Bazen AOX genleri silinmiş suşlar, rekombinant protein üretiminde doğal tip suşlardan daha iyi olabilmektedir. Ayrıca bu suşlar ekspresyon tetiklemesi için daha az metanol gerektirmektedir. Büyük ölçekli fermentasyonlar için az miktarda metanol gereksinimi, Mut- suşunu diğer suşlara göre avantajlı kılmaktadır.Çalışma iki bölümden oluşmaktadır. İlk bölümü, P.pastoris'te AOX genlerinin (AOX1 ve AOX2) inaktif edilmesidir. AOX1 ve AOX2 genleri, sırası ile ADE1 ve HIS4 genlerinin entegrasyonu ile inaktif edilmiştir. ADE1 ve HIS4, aynı zamanda seçici markırlardır. Bu bölümün sonucu olarak, P. pastoris MK321 (his4::PHIS4, aox1::ADE1), MK431 (ade1::PADE1 aox2::HIS4) ve MK500 (aox1::ADE1 aox2::HIS4) suşları elde edilmiştir.İkinci bölümde, bu suşların protein üretimi üzerine çalışılmıştır. EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) 'nin hücre dışında üretimi için suşlara pPICZ?A vektörü kullanılarak model protein olan EGFP geni aktarılmıştır. Ayrıca, rekombinant protein üretiminde sık kullanılan, P. pastoris X33 ve KM71H ticari suşlarına da aynı gen aktarılmıştır. Protein üreten X33, KM71H, MK321, MK431 ve MK500 suşlarından tek kopya plazmid içeren klonlar Southern Blot tekniği ile seçilmiş ve bu klonlarda protein üretimleri karşılaştırılmıştır.Bu çalışmada elde edilen P. pastoris MK500 suşunun rekombinant protein üretimlerinde yaygın olarak kullanılan P. pastoris X33 suşundan daha yüksek spesifik verimlilikle protein üretme (FU/OD) yeteneğine sahip olduğu görülmüştür. EGFP 'nin hücre dışına salgılandığı SDS-PAGE ve Western Blot teknikleri ile doğrulanmıştır.Sonuç olarak, yeni geliştirilen konukçu sistem olan P. pastoris MK500, metanolü metabolize edememektedir ve bu yüzden metanole sadece tetikleyici olarak ihtiyaç duymaktadır. Böylece bu suş, endüstriyel ölçekte rekombinant protein üretimlerinin çok düşük miktarda metanol ile gerçekleştirilmesine olanak sağlayacaktır.